病毒是可引發疾病的微生物,比細菌小,由蛋白質外殼、包膜和含有DNA或RNA的內核構成,病毒依靠活細胞實現自我復制。而宣稱能消毒的各式空氣凈化器、消毒器械、消毒劑及具有抗病毒功效的口罩、紡織品等產品或材料,是否能夠達標消毒或抗毒的標準,無一不需要經過
病毒滅活試驗。本文特此探討百檢網實驗室是如何進行病毒滅活試驗的。
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病毒滅活試驗的適用范圍
主要適用于消毒產品鑒定或日常監測。用具有一定代表性的、活的病毒及其細胞感染技術,評價各種用途的消毒因子對測試病毒的殺滅效果。按此方法進行的試驗,只是對消毒因子的滅活病毒能力的重要方面進行驗證。
病毒滅活試驗的試驗器材
(1)試驗用病毒株:脊髓灰質炎病毒1型(poliovirus-Ⅰ ,PV-Ⅰ)疫苗株;艾滋病病毒Ⅰ型(HIV-1)美國株。
(2)宿主細胞:可采用VERO細胞系、BGM細胞、Hela細胞系或FL細胞系,作為PV-1的測試細胞。用含有人T淋巴細胞白血病病毒Ⅰ型( human T cell leukemiavirus 1,HTLV-1)基因的人淋巴細胞(MT4株)作為HIV-1的測試細胞。
(3)細胞培養瓶與96孔培養板。(4)恒溫水浴箱。
(5)二氧化碳培養箱。
(6)層流超凈工作臺。
(7)低溫冰箱(-20℃,-80℃)。
(8)液蠶罐。
(9)倒置顯微鏡。
(10)離心機。
(11)可調移液器及配套一次性塑料吸頭。
(12)細胞維持培養基。
(13)細胞完全培養基。
(14)去離子水。
病毒滅活試驗的病毒懸液制備
(1)從液氮中取出凍存的試驗用宿主細胞,在37℃溫水中迅速融化,用毛細吸管移植于含有細胞維持液的細胞管內,吹吸數次,使混勻,立即離心(3000r/min,3min),去上清液。再加入適當的細胞維持液,吹吸數次,使混勻,同上離心后,轉種于加有10ml完全培養基的培養瓶中。逐日觀察細胞生長情況,在細胞長滿單層時,用于消毒試驗。
(2)取出低溫凍存的試驗病毒毒種,37℃水浴融化,用細胞維持液作10倍稀釋,然后接種于已經長滿單層細胞的細胞瓶內,置37℃溫箱中,使與細胞吸附、生長。逐日觀察病變,待3/4細胞出現病變時,收獲病毒。
(3)將含有病毒及宿主細胞的培養液,在冰浴條件下,用超聲波(或反復凍融)破碎宿主細胞,釋放病毒。然后,盡快離心(6000r/min,15min)去除沉淀(主要為細胞碎片),上清液即為所需的病毒懸液。按每管1.Oml分裝于無菌離心管(1.5ml)中-
(4)取1支病毒懸液,按病毒滴度測定法,測定其病毒滴度。其余均冷凍保存于-80℃備用。
病毒滅活試驗的滴度計算方法
(1)終點稀釋法病毒感染滴度的計算
以半數細胞感染劑量(TCID50)表示。TCID50的對數值計算公式如下。
TCID50對數值=病變率高于50%組稀釋度的對數值+距離比例
(2)噬斑法病毒感染滴度的計算
噬斑法病毒感染滴度,以噬斑形成單位數( pfu),簡稱噬斑數表示。計數方法同活菌培養計數技術。
每毫升測試樣品中的病毒含量計算(pfu/ml)=平板平均噬斑數×稀釋倍數
(3)平均滅活對數值的計算
平均滅活對數值按下式計算:設陽性(病毒)對照組平均病毒感染滴度(TCID50或pfu)的為No,試驗(消毒)組平均病毒感染滴度(TCI,50或pfu)為Nx。
平均滅活對數值= log No—log Nx
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