1 范圍

本標準規定了靈芝及其制品中靈芝酸A和靈芝酸B的高效液相色譜測定方法。

本標準適用于靈芝及其制品靈芝酸A和靈芝酸B的測定。

本標準靈芝酸A和靈芝酸B的定量測定范圍均為30mg/kg~500mg/kg。

本標準靈芝酸A和靈芝酸B的檢測限均為10mg/kg。

2 規范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其*新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。

GB/T 6682 分析實驗室用水規格和試驗方法

3 原理

試樣中靈芝酸A和靈芝酸B用甲醇超聲提取，提取液經氮氣吹干后甲醇溶解，高效液相色譜法測定，以保留時間進行定性，外標法定量。

4 試劑

除非另有規定，僅使用色譜純試劑和符合GB/T 6682 中規定的一級水。

4.1 甲醇(CH3OH)。

4.2 甲酸(CH2O2)。

4.3 乙腈(CH3CN)。

4.4 0.1%甲酸水溶液：取1m甲酸(4.2)定容至1L。

4.5 靈芝酸A(CAS號81907-62-2)和靈芝酸B(CAS號81907-61-1)：純度≥96%。

4.6 標準溶液：準確稱取靈芝酸A(4.5)和靈芝酸B(4.5)標準品各10mg(精確至0.1mg)，用甲醇定容至10mL。該混合標準液中靈芝酸A和靈芝酸B的質量濃度均為1000μg/m，-18℃冰箱保存，有效期3個月。

5 儀器和設備

5.1 高效液相色譜儀，配紫外檢測器或二*管陣列檢測器。

5.2 超聲波清洗器，功率大于450W，頻率50Hz~100Hz。

5.3 分析天平，感量0.01g和感量0.0001g。

5.4 有機系濾膜，0.45μm。

5.5 樣品粉碎機。

5.6 氮氣吹干儀。

6 分析步驟

6.1 試樣制備

取不少于200g具代表性靈芝子實體，用樣品粉碎機(5.5)粉碎(超細粉等無需粉碎)，將樣品裝于密封容器中，制成待測樣，0℃~20℃保存備用。

6.2 試樣提取

稱取粉碎均勻的試樣0.5g(精確至0.001g)于50mL離心管中，加甲醇(4.1)25mL搖勻，置于超聲波清洗器(5.2)中超聲提取30min，提取液經濾紙過濾，取濾液5mL置于10mL刻度試管中，于50℃左右氮氣吹干，殘留物用1.0mL甲醇(4.1)溶解，過濾膜(5.4)，供高效液相色譜儀分析。

6.3 測定

6.3.1 色譜參考條件

色譜柱：C18柱，250mm×4.6mm(i.d.)，5μm，或相當規格色譜柱。

流動相：乙腈(4.3)+0.1%甲酸水溶液(4.4)=30+70

流速：1.0mL/min。

柱溫：40℃。

波長：258nm。

進樣量：20μL。

6.3.2 標準曲線

準確吸取適量混合標準溶液(4.6)用甲醇稀釋，配制質量濃度為1.00μg/mL、2.00μg/mL、5.00μg/mL、10.0μg/m、20.0μg/mL和50.0μg/mL的標準工作液，按參考色譜條件測定，以靈芝酸A和靈芝酸B的質量濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線或計算線性回歸方程。標準品色譜圖參見圖A.1。

6.3.3 測定

按照保留時間進行定性，樣品與標準品保留時間的相對偏差不大于2%，單點或多點校正外標法定量。待測樣液中靈芝酸A和靈芝酸B的響應值應在標準曲線范圍內，超過線性范圍則應稀釋后再進樣分析。同時做空白試驗。

7 結果計算

試樣中靈芝酸A和靈芝酸B的量以質量分數a計，單位以毫克每千克(mg/kg)表示，按式(1)計算。

w=A*p*V/（As*m）*f

式中：

A——試樣中靈芝酸A或靈芝酸B的峰面積；

As——標準工作液中靈芝酸A或靈芝酸B的峰面積；

p——標準工作液中靈芝酸A或靈芝酸B的質量濃度，單位為微克每毫升(pg/mL)；

V——試樣液*終定容體積，單位為毫升(mL)；

m——試樣的質量，單位為克(g)；

f——樣品稀釋倍數。

以兩次平行測定值得算數平均值作為測定結果，計算結果保留三位有效數字。

8 精密度

8.1 重復性

在重復性條件下獲得的兩次獨立測試結果的**差值不大于這兩個測定值的算術平均值的5%。

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下載地址：《NY/T 2278-2012 靈芝產品中靈芝酸含量的測定 高效液相色譜法》