1.范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中蠟樣芽胞桿菌( Bacillus cereus)的檢驗(yàn)方法。

本標(biāo)準(zhǔn)**法適用于蠟樣芽胞杄菌含量較髙的食品中蠟樣芽胞杄菌的計(jì)數(shù);第二法適用于蠟樣芽胞杄菌含量較低的食品樣品中蠟樣芽胞杄菌的計(jì)數(shù)。

2.設(shè)備和材料

除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下：

a) 冰箱:2℃～5℃;

b) 恒溫培養(yǎng)箱:30℃±1℃、36℃±1℃;

c) 均質(zhì)器;

d) 電子天平:感量0.1g;

e) 無菌錐形瓶:100mL、500mL;

f) 無菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸頭;

g) 無菌平皿:直徑90mm;

h) 無菌試管:18mm×180mm；

i) 顯微鏡:10倍～100倍(油鏡)；

j) L涂布棒。

3.培養(yǎng)基和試劑

3.1 磷酸鹽緩沖液(PBS):見附錄A中A.1。

3.2 甘露醇卵黃多黏菌素(MYP)瓊脂:見附錄A中A.2。

3.3 胰酪胨大豆多黏菌素肉湯:見附錄A中A3。

3.4 營(yíng)養(yǎng)瓊脂:見附錄A中A4。

3.5 過氧化氫溶液:見附錄A中A.5。

3.6 動(dòng)力培養(yǎng)基:見附錄A中A.6。

3.7 硝酸鹽肉湯:見附錄A中A.7。

3.8 酪蛋白瓊脂:見附錄A中A8。

3.9 硫酸錳營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:見附錄A中A9。

3.10 0.5%堿性復(fù)紅:見附錄A中A.10。

3.11 動(dòng)力培養(yǎng)基:見附錄A中A.11。

3.12 糖發(fā)酵管:見附錄A中A.12。

3.13 V-P培養(yǎng)基:見附錄A中A.13。

3.14 胰酪胨大豆羊血(TSSB)瓊脂:見附錄A中A.14。

3.15 溶菌酶營(yíng)養(yǎng)肉湯:見附錄A中A.15。

3.16 西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基:見附錄A中A.16。

3.17 明膠培養(yǎng)基:見附錄A中A.17。

4.蠟樣芽胞杄菌平板計(jì)數(shù)法(**法)

4.1 檢驗(yàn)程序

蠟樣芽胞桿菌平板計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序見圖1。

4.2 操作步驟

4.2.1 樣品處理

冷凍樣品應(yīng)在45℃以下不超過15min或在2℃～5℃不超過18h解凍,若不能及時(shí)檢驗(yàn),應(yīng)放于-10℃～-20℃保存;非冷凍而易腐的樣品應(yīng)盡可能及時(shí)檢驗(yàn),若不能及時(shí)檢驗(yàn),應(yīng)置于2℃～5℃冰箱保存,24h內(nèi)檢驗(yàn)。

4.2.2 樣品制備

稱取樣品25g,放入盛有225mL PBS或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi),用旋轉(zhuǎn)刀片式均質(zhì)器以8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min,或放入盛有225 mL PBS或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打lmin～2min。若樣品為液態(tài),吸取25mL樣品至盛有225 mL PBS或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶?jī)?nèi)可預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中,振蕩混勻,作為1:10的樣品勻液。

4.2.3 樣品的稀釋

吸取4.2.2中1:10的樣品勻液1mL加到裝有9 mL PBS或生理鹽水的稀釋管中,充分混勻制成1:100的樣品勻液。跟據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì),按上述操作,依次制成十倍遞増系列稀釋樣品勻液。每遞増稀釋1次,換用1支1mL無菌吸管或吸頭。

4.2.4 樣品接種

根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì),選擇2個(gè)~3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液),以0.3mL、0.3mL、0.4mL接種量分別移入三塊MYP瓊脂平板,然后用無菌L棒涂布整個(gè)平板,注意不要觸及平板邊緣。使用前,如MYP瓊脂平板表面有水珠,可放在25℃~50℃的培養(yǎng)箱里干燥,直到平板表面的水珠消失。

4.2.5 分離、培養(yǎng)

4.2.5.1 分離

在通常情況下,涂布后,將平板靜置10min。如樣液不易吸收,可將平板放在培養(yǎng)箱30℃±1℃培養(yǎng)1h,等樣品勻液吸收后翻轉(zhuǎn)平皿,倒置于培養(yǎng)箱,30℃±1℃培養(yǎng)24h±2h。如果菌落不典型,可繼續(xù)培養(yǎng)24h±2h再觀察。在MYP瓊脂平板上,典型菌落為微粉紅色(表示不發(fā)酵甘露醇),周圍有白色至淡粉紅色沉淀環(huán)(表示產(chǎn)卵磷脂酶)。

4.2.5.2 純培養(yǎng)

從每個(gè)平板(符合44.1.1要求的平板)中挑取至少5個(gè)典型菌落(小于5個(gè)全選),分別劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板做純培養(yǎng),30℃±l℃培養(yǎng)24h±2h,進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上,典型菌落為灰白色,偶有黃綠色,不透明,表面粗糙似毛玻璃狀或融蠟狀,邊緣常呈擴(kuò)展?fàn)?直徑為4mm～10mm。

4.3 確定鑒定

4.3.1 染色鏡檢

挑取純培養(yǎng)的單個(gè)菌落,革蘭氏染色鏡檢。蠟樣芽胞桿菌為革蘭氏陽(yáng)性芽胞桿菌,大小為(1μm～1.3μm)ⅹ(3μm～5μm),芽胞呈橢圓形位于菌體中央或偏端,不膨大于菌體,菌體兩端較平整,多呈短鏈或長(zhǎng)鏈狀排列。

4.3.2 生化鑒定

4.3.2.1 概述

挑取純培養(yǎng)的單個(gè)菌落,進(jìn)行過氧化氫酶試驗(yàn)、動(dòng)力試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、酪蛋白分解試驗(yàn)、溶菌酶耐性試驗(yàn)、ⅴ-P試驗(yàn)、葡萄糖利用(厭氧)試驗(yàn)、根狀生長(zhǎng)試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗(yàn)。蠟樣芽胞桿菌生化特征與其他芽胞桿菌的區(qū)別見表1。

更多標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容點(diǎn)擊以下鏈接獲取標(biāo)準(zhǔn)全文：

下載地址：《GB 4789.14-2014 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)》