1 范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了養(yǎng)殖水體中孔雀石綠殘留量的測(cè)定-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法的原理、試劑、儀器設(shè)備、測(cè)定步驟、結(jié)果計(jì)算、檢出限、回收率和精密度。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于漁業(yè)生產(chǎn)養(yǎng)殖水體中孔雀石綠殘留量的測(cè)定。本方法的檢出限為0.05ug/L。

2 規(guī)范性引用文件

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GB/T 6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3 原理

樣品中的孔雀石綠用乙腈和二氯甲烷液液萃取，反相色譜柱分離，質(zhì)譜檢測(cè)器檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量。

4 試劑

4.1 乙腈：色譜純。

4.2 二氯甲烷。

4.3 無水乙酸銨。

4.4 甲酸。

4.5 甲酸溶液[1+1000]：準(zhǔn)確吸取1.00mL甲酸溶于1000mL水中，經(jīng)0.22μm混合纖維素濾膜過濾。

4.6 乙酸銨緩沖溶液[5mol/L]：稱取0.385g無水乙酸銨溶解于1000mL水中，冰乙酸調(diào)pH到4.5。

4.7 乙腈-乙酸銨混合溶液(1+1)：500mL乙腈與500mL乙酸銨溶液(4.6)超聲混合5min。

4.8 鹽酸羥胺。

4.9 鹽酸羥胺溶液[0.25g/mL]：稱取25g鹽酸羥胺溶于100mL水中。

4.10 對(duì)-甲苯磺酸。

4.11 對(duì)-甲苯磺酸溶液[1.0mol/L]：稱取17.2g對(duì)-甲苯磺酸，用水溶解，并定容至100mL。

4.12 標(biāo)準(zhǔn)品：孔雀石綠(MG)、氘代孔雀石綠(D5-MG)，純度≥98%。

4.13 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

4.13.1 孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液[1.0mg/mL]：準(zhǔn)確稱取10.0mg的孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，-18℃避光保存，保存期3個(gè)月。

4.13.2 氘代孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液[1.Omg/mL]：準(zhǔn)確稱取10.00mg的氘代孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配制成1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，-18℃避光保存，保存期3個(gè)月。

4.14 孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)工作溶液[l00ng/mL、10.0ng/mL]：準(zhǔn)確吸取孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(4.13.1)，用乙腈逐級(jí)稀釋配成100ng/mL和10.0ng/mL的工作溶液，-18℃避光保存，保存期7天。

4.15 氘代孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)工作溶液[l00ng/mL]：準(zhǔn)確吸取氘代孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(4.13.2)，用乙腈逐級(jí)稀釋配成100ng/mL的工作溶液，-18℃避光保存，保存期7天。

注：除非另作說明，本方法所用試劑均為分析純，試驗(yàn)用水符合GB/T 6682 一級(jí)水指標(biāo)。

5 儀器和設(shè)備

5.1 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀。

5.2 電子天平：感量0.01mg。

5.3 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

5.4 旋渦振蕩器。

5.5 超聲波振蕩器。

6 測(cè)定步驟

6.1 樣品處理

6.1.1 吸取水樣50.00mL，置于250mL分液漏斗中。向分液漏斗中加入20.0μL氘代孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(4.15)、1.5mL鹽酸羥胺溶液(4.9)、2.5mL對(duì)-甲苯磺酸溶液(4.11)，振搖混勻。

6.1.2 加入10.0mL乙腈、25.0mL二氯甲烷，劇烈振搖3min，靜置分層10min，將下層溶液轉(zhuǎn)移至125mL雞心瓶中。

6.1.3 繼續(xù)向分液漏斗中加入10.0mL乙腈、25.0mL二氯甲烷，劇烈振搖3min，靜置分層10min，合并下層溶液于上述125mL雞心瓶中，于45℃±2℃水浴中減壓濃縮至近干。

6.1.4 向雞心瓶中加入1.00mL乙腈-乙酸銨混合溶液(4.7)，渦旋振蕩lmin、超聲振蕩lmin，樣液經(jīng)0.22μm針孔式有機(jī)相濾膜過濾后供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定。

6.2 空白試驗(yàn)

準(zhǔn)確量取50.00mL不含孔雀石綠的水樣，按樣品處理步驟進(jìn)行。

6.3.1 色譜條件

6.3.1.1 色譜柱：C柱，100mm×3.0mm(內(nèi)徑)，粒度1.8μm。

6.3.1.2 流動(dòng)相：乙腈十甲酸水溶液(0.1%)=60+40(V/V)。

6.3.1.3 流速：0.25mL/min。

6.3.1.4 柱溫：35℃。

6.3.1.5 進(jìn)樣量：10μL。

6.3.2 質(zhì)譜條件

6.3.2.1 離子源：電噴霧ESI源，正離子模式。

6.3.2.2 掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM。

6.3.2.3 霧化氣壓力：40psi。

6.3.2.4 霧化氣溫度：350℃。

6.3.2.5 霧化氣、干燥氣為高純氮?dú)猓瑲怏w流量：10L/min。

6.3.2.6 碰撞氣為高純氮?dú)猓瑲怏w壓力：0.15MPa。

6.3.2.7 監(jiān)測(cè)離子對(duì)：孔雀石綠m/z 329/313、329/208；氘代孔雀石綠m/z 334/318。

6.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

檢測(cè)前，吸取孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(4.14)、氘代孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)工作溶液[4.15]適量，用流動(dòng)相配制成濃度分別為0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.10ng/mL、0.50ng/mL、1.00ng/mL、2.00ng/mL、5.00ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，每亳升該溶液含有氘代孔雀石綠2.0ng。將此混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液按6.3的儀器條件測(cè)定，孔雀石綠以氘代孔雀石綠為內(nèi)標(biāo)物，通過儀器工作站制定內(nèi)標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)曲線。

6.5 定性依據(jù)

在同樣測(cè)試條件下，陽性樣品保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)保留時(shí)間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在士5%以內(nèi)，且檢測(cè)到的離子的相對(duì)豐度，用與*強(qiáng)離子(基峰)的強(qiáng)度百分比表示，應(yīng)當(dāng)與濃度相當(dāng)?shù)男Ｕ龢?biāo)準(zhǔn)相對(duì)豐度一致。

6.6 定量測(cè)定

將樣品制備液按6.3測(cè)定，通過儀器工作站計(jì)算制備液中孔雀石綠的濃度。在上述條件下，標(biāo)準(zhǔn)溶液中孔雀石綠、氘代孔雀石綠的參考保留時(shí)間分別為2.203min、2.184min，標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖及質(zhì)譜圖參見附錄A。

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