蓮別稱荷花，是蓮科(Nelumbonaceae)蓮屬(Nelumbo)的多年生挺水植物，是*古老的雙子葉植物之一，目前僅存有美洲蓮(Nelumbo lutea)和亞洲蓮(N. nucifera)2個種。荷花集觀賞、食用、藥用等功能于一體，具有重要的文化價值、經(jīng)濟價值、生態(tài)價值[1-2]。
花粉是植物體上起生殖作用的雄配子體[3]，其活力直接影響到植物受精和結(jié)實過程，較高的花粉活力可以提高植物的結(jié)實率和育種成效。荷花花粉含有豐富的類黃酮，目前針對荷花藥用價值的研究較多[4-5]，而對其活力的研究較少[6]。全世界目前已有的2 000多個荷花品種主要由中國和日本培育而成[7]，育種方法主要是自然雜交和人工雜交，少部分采用物理或化學(xué)誘變方法[8-10]，然而在荷花雜交過程中常出現(xiàn)不結(jié)實或結(jié)實率低的問題。因此，了解花粉活力情況對于荷花雜交育種過程至關(guān)重要，如不同種類的荷花花粉活力是否存在差異及差異多大，如何更有效地檢測荷花的花粉活力，如何更有效地儲藏花粉使其活力保存較長時間等問題目前尚不清楚。
離體培養(yǎng)法和染色法是測定植物花粉活力的常用方法，已經(jīng)在百合[11]、牡丹[12]、巴旦木[13]、菊花[14]、君子蘭[15]等植物中得到了廣泛應(yīng)用。本研究以不同資源荷花的花粉為試驗材料，分別采用離體培養(yǎng)法、碘-碘化鉀(I2-KI)染色法、2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法進行活力檢測，以離體培養(yǎng)法作為參照，比較2種染色方法的測定結(jié)果，從而對不同資源荷花的花粉活力進行比較分析。
在對荷花進行人工雜交前，先對花粉活力進行準確有效的檢測，選出花粉活力強的品種作為父本，進而選擇合適的雜交母本，是保證雜交育種工作順利開展和提高效率的重要條件。本研究期望得出有效、快速地檢測荷花花粉活力的方法，從而篩選出花粉活力較高的荷花品種，為荷花新品種的高效培育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法
1.1 試驗材料
表1中的試驗材料為取自上海辰山植物園國家荷花資源圃的11份不同資源的荷花，包括美洲蓮、亞洲蓮及亞美雜交蓮，均為單瓣型(圖1)，因考慮到單瓣型荷花雄蕊發(fā)育正常，花粉活力通常更高。試驗材料采集時選擇天氣晴朗的08：00左右，選取開花第2天的荷花，荷花花蕾在開花前用種子袋套上，避免因蜜蜂采蜜導(dǎo)致授粉雜交。試驗于2020年7—9月在上海辰山植物園中國科學(xué)院上海辰山植物科學(xué)研究中心的觀賞植物資源及創(chuàng)新利用研究組247實驗室內(nèi)完成。

1.2 試驗方法
1.2.1 花粉的收集 用一次性唇刷將花粉從花藥上輕刷下來，放在培養(yǎng)皿中的硫酸紙上，蓋上培養(yǎng)皿備用。

1.2.2 培養(yǎng)基的選擇 影響花粉萌發(fā)的主要因素有蔗糖、硼酸等[16]。聚乙二醇(PEG)可以促進種子萌發(fā)[17]，也可以使花粉緩慢水合，從而較長時間地維持花粉膨壓，對花粉萌發(fā)也有一定的促進作用[18-20]。由前期的試驗結(jié)果可知，荷花在固體培養(yǎng)基上的萌發(fā)率較低，結(jié)合孫春青等的方法[21]，*終選用液體培養(yǎng)基。
為了得到適用于大多數(shù)荷花花粉萌發(fā)的培養(yǎng)基，設(shè)置PEG-4000(含量分別為0、10%、15%)、蔗糖(含量分別為0、5%、10%)、硼酸(含量分別為0、0.01%、0.02%)3個因素的3個水平，共設(shè)計15種組成不一的培養(yǎng)基(表2)，并選擇3個荷花品種的花粉做培養(yǎng)基篩選試驗，分別為粉霸王、易建蓮、巨姚。分別將3個荷花品種的花粉撒于15種培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)箱中于30 ℃培養(yǎng)4 h后，使用奧林巴斯BX43正置顯微鏡，在放大10倍的條件下觀察花粉的萌發(fā)情況，統(tǒng)計萌發(fā)率。在離體培養(yǎng)法中，當花粉管的長度大于花粉粒的直徑時視為萌發(fā)[22]。

1.2.3 離體培養(yǎng)法 配制培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基置于干凈的凹面載玻片上，取花粉均勻撒在培養(yǎng)基上，然后將其放入內(nèi)置濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)箱中于30 ℃培養(yǎng)4 h后，鏡檢觀察花粉的萌發(fā)情況，統(tǒng)計萌發(fā)率。每個處理設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)觀察3個視野。

1.2.4 I2-KI染色法 配制I2-KI溶液(稱量 0.2 g KI溶于8 mL蒸餾水中，充分溶解后，加入 0.1 g I2定容至30 mL，振蕩使其充分溶解)于棕色滴瓶中，避光備用。取適量花粉于PCR管中，將PCR管用錫箔紙包裹避光，再向管中加入200 μL I2-KI 溶液，輕輕振蕩混勻，然后在黑暗條件下染色5 min。滴2～3滴染色液于載玻片上，鏡檢觀察，被染成藍色的花粉視為有活力，未被染色的花粉則視為無活力。上述每個處理設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)觀察3個視野。

1.2.5 TTC染色法 配制0.5%TTC溶液(稱量0.05 g TTC溶于10 mL磷酸緩沖液中)于棕色滴瓶中，避光備用，溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用。取適量花粉于PCR管中，將PCR管用錫箔紙包裹避光，再向管中加入200 μL TTC溶液，輕輕振蕩混勻，然后放入 37 ℃ 培養(yǎng)箱中黑暗染色15 min。滴2～3滴染色液于載玻片上，鏡檢觀察，被染成紅色的花粉是有活力的，未被染色的花粉是無活力的。上述每個處理設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)觀察3個視野。

1.3 數(shù)據(jù)處理
用Excel對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。離體培養(yǎng)法的花粉活力計算公式：花粉萌發(fā)率=已萌發(fā)的花粉粒數(shù)/花粉?？倲?shù)×****；染色法的花粉活力計算公式：花粉染色率=已染色的花粉粒數(shù)/花粉粒總數(shù)×****。

2 結(jié)果與分析
2.1 培養(yǎng)基的篩選
如圖2所示，在PEG-4000濃度為0的培養(yǎng)基上，1-1、1-2、1-3、1-4、1-5培養(yǎng)基中的花粉未萌發(fā)；在PEG-4000含量為15%的培養(yǎng)基上，3-2、3-3、3-4、3-5培養(yǎng)基中的花粉幾乎未萌發(fā)(萌發(fā)率<1%)；在 PEG-4000含量為10%的培養(yǎng)基上，2-1、2-2、2-3、2-4、2-5培養(yǎng)基中的花粉萌發(fā)情況較好。由此看出，適宜含量的PEG-4000確實可以提高荷花花粉的萌發(fā)率，但當含量過高時，反而會抑制其萌發(fā)。同時發(fā)現(xiàn)，蔗糖含量為0時，花粉的萌發(fā)率較高，蔗糖含量為5%、10%時，花粉的萌發(fā)率偏低，表明萌發(fā)率隨著蔗糖含量升高而降低。而花粉萌發(fā)率在硼酸含量為0.02%的培養(yǎng)基上較高，在硼酸含量為0.01%的培養(yǎng)基上較低。在2-5培養(yǎng)基上，易建蓮荷花品種的平均花粉萌發(fā)率*高。綜合考慮，為了滿足大多數(shù)荷花的花粉都能良好萌發(fā)且萌發(fā)條件一致，選擇2-5培養(yǎng)基用于花粉萌發(fā)。
選擇易建蓮進行進一步的試驗，然而由于2-5培養(yǎng)基的蔗糖含量為0，因此設(shè)定PEG-4000含量為10%、硼酸含量為0.02%，添加不同含量的蔗糖再次進行培養(yǎng)基試驗。由表3可以看出，易建蓮花粉在5種培養(yǎng)基上的萌發(fā)率隨著蔗糖含量的升高而先升高后降低，在5-1培養(yǎng)基上達到*高值，為9.86%，說明一定濃度的蔗糖可以促進花粉萌發(fā)，但當蔗糖含量過高時，花粉萌發(fā)反而被抑制。*終選擇5-1培養(yǎng)基作為測定荷花花粉活力的液體培養(yǎng)基，其配方：10%PEG-4000+0.02%硼酸+0.1%蔗糖。

2.2 2種染色法的觀測效果
在本試驗中，I2-KI染色法、TTC染色法均能對荷花的花粉進行有效染色(圖3-B、圖3-C)。在顯微鏡下，花粉形態(tài)清晰，但2種染色方法的著色區(qū)分度有較大差異。經(jīng)I2-KI染色后，大多數(shù)荷花花粉均呈褐黑色或黃褐色，*少數(shù)有未著色的花粉粒。經(jīng)TTC染色后，荷花花粉呈紅色或淡紅色，部分花粉粒未著色，易區(qū)分。

2.3 3種花粉活力檢測方法的比較
用3種方法檢測荷花花粉活力發(fā)現(xiàn)，離體培養(yǎng)法和TTC染色法檢測得到的所有荷花花粉的活力均低于45%，而I2-KI染色法檢測得到的荷花花粉活力均高于70%。
離體培養(yǎng)法使用前期試驗得到的*適培養(yǎng)基來檢測不同荷花的花粉活力。由圖4可以看出，用離體培養(yǎng)法檢測得到11種不同資源的荷花花粉萌發(fā)率均低于20.00%，其中單灑錦的花粉活力*高，為18.46%，黑龍江野生蓮的花粉活力*低，為6.70%。
使用I2-KI染色法測定荷花花粉活力時，染色后的花粉呈褐黑色或黃褐色，在顯微鏡觀察下發(fā)現(xiàn)其色差不明顯，同時花粉著色率*高，僅有少數(shù)花粉未著色。因此，如果僅以著色率來表示花粉的活力，那么I2-KI染色法檢測得到的不同荷花花粉的活力均超過70%(圖5)，這與離體培養(yǎng)得到的結(jié)果嚴重不符，因此認為這種染色法不適合用于檢測荷花花粉的活力。
使用TTC染色法測定荷花花粉活力時，不同荷花檢測得到的花粉活力差別較大。由圖6可以看出，越南蓮的花粉活力*高，達到了43.39%，江溪紅蓮的花粉活力*低，為11.24%。與離體培養(yǎng)結(jié)果比較可知，TTC染色法測得的花粉活力明顯偏高，此方法雖然容易操作，染色后花粉的著色情況容易區(qū)分，但是得到的結(jié)果普遍高于離體培養(yǎng)法，且與離體培養(yǎng)中得到的染色率比例不一致，不能準確反映花粉活力，因此該方法也不適用于荷花花粉活力的檢測。

3 討論與結(jié)論
花粉活力直接影響雜交授粉后卵子受精和結(jié)實率的結(jié)果，因此，雜交育種試驗之前需要了解荷花花粉的活力，優(yōu)先選擇花粉活力高的品種作為父本，更利于新品種的成功培育[23-25]。測定花粉活力的方法較多，不同植物適用的檢測方法不同?；ǚ刍盍z測多采用染色法，因其操作過程簡易、試驗耗時少、能在較短時間內(nèi)測定花粉活力等優(yōu)點而被應(yīng)用于各種植物中。研究發(fā)現(xiàn)，大部分檢測方法得到的花粉活力高于實際活力[3]。孫光玲等研究發(fā)現(xiàn)，花粉活力的測定以離體培養(yǎng)法更可靠[26]。于璐通過對不同番茄品種花粉活力的測定得出，TTC染色法比I2-KI染色法更適用[27]。王士泉對于四川牡丹同時使用亞歷山大染色法、TTC染色法和I2-KI染色法進行花粉活力的測定，并對其結(jié)果進行比較，認為四川牡丹更適用I2-KI染色法[28]。詹妮等發(fā)現(xiàn)，用離體培養(yǎng)法、過氧化物酶法和I2-KI染色法檢測的大葉相思的花粉活力無顯著差異[29]。