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植物提取物抗氧化活性檢測

作者:百檢網(wǎng) 時間:2022-08-11 來源:互聯(lián)網(wǎng)

在植物提取物檢測項(xiàng)目中,抗氧化活性是重要的評價指標(biāo)之一。抗氧化活性評價主要是通過試驗(yàn)了解提取物的抗衰老、抗疲勞、抗炎等生物活性的檢測項(xiàng)目。以槐米為例,由于含有豐富的黃酮、皂苷和甾醇等生物活性物質(zhì),槐米被公認(rèn)為是目前*具有抗氧化活性潛力的農(nóng)業(yè)廢棄物之一。槐米中提取的蘆丁,具有良好的抗氧化活性,此外在降血清膽固醇、降血壓、降血脂、降血糖和提高免疫力等多方面具有良好的功效。

主流抗氧化活性評價方法介紹


目前,植物提取物中抗氧化活性評價方法主要根據(jù)受試對象可以分為體內(nèi)法和體外法二大類。體內(nèi)方法以丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱苷肽等為指標(biāo),測定其含量來評價體內(nèi)抗氧化活性的高低。體外抗氧化評價體系則以自由基清除法、氧化還原法為主。體內(nèi)方法的優(yōu)勢是更接近人體結(jié)果,但一般費(fèi)時費(fèi)力,且只能反映某一指標(biāo)活性的高低。體外方法則很好地彌補(bǔ)了體內(nèi)法的缺點(diǎn)。其中,1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法是應(yīng)用*廣泛的抗氧化測定方法。

必須注意的是,常規(guī)的比色皿模式的 DPPH 測定法將DPPH 溶液與樣品直接混合,因此檢測得到的是樣品總的抗氧化活性。然而,植物提取物原料通常是多元抗氧化活性物質(zhì)混合物。當(dāng)這些物質(zhì)混合在一起被 DPPH 法測定的時候,相互之間可能存在抗氧化拮抗或協(xié)同的效應(yīng),導(dǎo)致檢測評估結(jié)果偏低或者偏高。

此外,在很多評價任務(wù)中,僅僅測定混合物樣品的總抗氧化性常規(guī)的抗氧化活性評價方法基于DPPH 分子與自由基混合后體系的顏色變化,利用紫外-可見分光光度計(jì)監(jiān)測其吸光度值變化可以實(shí)現(xiàn)對樣品中總抗氧化活性的定量分析。但必須注意的是,這種抗氧化評價方法有一個固有的缺點(diǎn):檢測選擇性差。更確切地說,當(dāng)樣品中含有兩種或者兩種以上的抗氧化活性物質(zhì)的時候,分析結(jié)果無法區(qū)分每一種物質(zhì)的抗氧化活性高低。

薄層色譜法介紹


薄層色譜法是建立在薄層色譜和 DPPH 顯色反應(yīng)聯(lián)用基礎(chǔ)上的抗氧化分析方法,因?yàn)榧鎮(zhèn)溥x擇性高和通用性好的優(yōu)點(diǎn),所以近年來廣泛應(yīng)用到植物提取物分析的一項(xiàng)色譜分離技術(shù)。與柱色譜的閉環(huán)工作原理不同,薄層色譜是一個去中心化、開放的分析系統(tǒng),分離過程結(jié)束后分離結(jié)果被保留在色譜板上而非廢液瓶中。這一獨(dú)特的優(yōu)勢使得薄層色譜的分離結(jié)果可以方便地與很多無法與傳統(tǒng)柱色譜系統(tǒng)兼容的檢測手段實(shí)現(xiàn)無障礙融合。因此,薄層色譜不僅是一種通量大、操作簡便和靈活性高的色譜工具,而且還可以作為多種離線檢測方法高效集成融合的分析平臺,在分析通量、簡便性、精密度和適用范圍等方面達(dá)到了較為理想的平衡,因此在植物提取物活性評價方面有良好的應(yīng)用前景。

更重要的是,薄層色譜法是目前**能與生化反應(yīng)直接聯(lián)用的色譜工具。和傳統(tǒng)的試管法測試不同,薄層色譜的色譜分離結(jié)果開放性和反應(yīng)載體功能可以從根本上解決基于 DPPH 變色反應(yīng)的抗氧化評估方法選擇性差的問題。薄層分離使原本混在一起的不同抗氧化物質(zhì)按分子結(jié)構(gòu)的差異移動到薄層板上不同的位置形成物理隔離,因而可以有效避免各種物質(zhì)之間可存在的協(xié)同或拮抗效應(yīng);隨后,通過浸漬方式與薄層板耦合的 DPPH 溶液可以方便地實(shí)現(xiàn)對混合物中不同抗氧化組分的同時評估。因此,相對于傳統(tǒng)的方法,建立在薄層色譜和 DPPH 顯色反應(yīng)基礎(chǔ)上的抗氧化評價方法更加可靠。

目前,薄層色譜法已發(fā)展具備一整套完整的儀器化操作平臺,在點(diǎn)樣、展開、浸漬衍生和掃描定量過程中均實(shí)現(xiàn)了半自動甚至全自動化,顯著擴(kuò)展了應(yīng)用范圍。其中,半自動薄層點(diǎn)樣儀在高壓氮?dú)饬鞯膮f(xié)助下,點(diǎn)樣針內(nèi)的液體樣品以*細(xì)的液流形式被吹掃至色譜板上,點(diǎn)樣體積通常在 1——10 μL 范圍內(nèi)。通過非接觸吹 掃法進(jìn)行條帶狀點(diǎn)樣,可以顯著提高分離后相鄰斑點(diǎn)的分辨率。薄層色譜分析過程中,所有步驟獨(dú)立并配備相對應(yīng)設(shè)備,可同時進(jìn)行操作和分析,不僅提高了工作效率,也增加了儀器選擇的靈活性。儀器化的操作平臺在很大程度上提高了色譜分離的靈敏度及色譜展開圖的分辨率,同時可視化成像后的光密度掃描提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。

薄層色譜法要點(diǎn)分析


采用薄層色譜法來評價植物提取物的抗氧化活性,主要是利用硅膠薄層色譜對槐米提取物的甲醇溶液進(jìn)行展開,實(shí)現(xiàn)對其中多種抗氧化物質(zhì)的色譜分離,然后通過浸漬的方式將停留在硅膠薄層上的分離結(jié)果與 DPPH 顯色反應(yīng)相耦合,顯色反應(yīng)結(jié)果用光密度掃描儀定量檢測,檢測結(jié)果以蘆丁為內(nèi)標(biāo)加權(quán)定量計(jì)算評估槐米樣品綜合抗氧化能力。我們可以通過分析代表性抗氧化活性化合物的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn),來優(yōu)化色譜分離和 DPPH 顯色等關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)。

該方法的要點(diǎn)有:


(1)以甲醇為溶劑提取槐米提取物中的抗氧化活性成分

(2)通過超聲進(jìn)行輔助提取

(3)采用硅膠薄層板為固定相

(4)乙酸乙酯+乙酸+甲酸+水 10+1.1+1.1+2 mL 為流動相

(5)浸漬 DPPH 溶液顯色 15 分鐘

(6)熒光模式,D2&W 燈,激發(fā)光波長 530 nm,無濾光片,狹縫尺寸 3.00 × 0.30 mm (Micro),掃描速度 100 mm/s, 數(shù)據(jù)分辨率 100 μm/step。

通過上面的分析,我們可以很容易了解到目前來看薄層色譜法在評價植物提取物的氧化活性方面,具有更穩(wěn)定、可靠和實(shí)用性。

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