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檢測(cè)范圍

體外哺乳類細(xì)胞基因突變實(shí)驗(yàn)，化妝品基因突變實(shí)驗(yàn)，小鼠淋巴瘤基因突變實(shí)驗(yàn)，酵母菌基因突變實(shí)驗(yàn)，

野生型質(zhì)粒構(gòu)建

1.引物設(shè)計(jì)：根據(jù)需要驗(yàn)證的基因序列，設(shè)計(jì)需要擴(kuò)增的基因片段引物。

2. 線性化質(zhì)粒：將原始的質(zhì)粒載體，比如 pcDNA3.1 質(zhì)粒，選擇合適的酶切位點(diǎn)，比如 NheI/KpnI 進(jìn)行酶切，獲得線性化的質(zhì)粒。

3. 質(zhì)粒連接：將線性化的載體與目的基因的連接，推薦在 10~20μl 反應(yīng)體系中進(jìn)行連接反應(yīng)，可以選擇 T4 酶進(jìn)行黏性末端的連接。

4. 轉(zhuǎn)化涂板：將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到受體菌中(一般為 DH5a)，涂板，培養(yǎng)過夜。次日，挑取平板上單克隆菌落進(jìn)行搖菌, 送菌液測(cè)序，得到野生型質(zhì)粒。

突變型質(zhì)粒構(gòu)建

在得到野生型質(zhì)粒之后，下一步就是對(duì)目的基因片段進(jìn)行突變啦，即將目的基因上面的一個(gè)堿基或多個(gè)堿基換成另外的堿基。

1.突變引物設(shè)計(jì): 向質(zhì)粒進(jìn)行單點(diǎn)或者多點(diǎn)突變，只需要設(shè)計(jì)一對(duì)引物，進(jìn)行 PCR 的擴(kuò)增，替換掉野生型基因的突變位點(diǎn)堿基。

2.突變質(zhì)粒的擴(kuò)增：突變質(zhì)粒的擴(kuò)增過程中，需要選用高保真酶 Pfu 酶進(jìn)行質(zhì)粒擴(kuò)增, 防止引進(jìn)新的突變。通過 PCR 過程，突變型質(zhì)粒也得到了擴(kuò)增。

3. 得到 PCR 產(chǎn)物后，將產(chǎn)物立即置于冰上，然后在 PCR 反應(yīng)體系中加入 1 微升 Dpn I，混勻后 37℃孵育 1-2 小時(shí)。DpnI 能夠識(shí)別甲基化位點(diǎn)并將其酶切。從大腸桿菌里提取原始質(zhì)粒模板一般都被甲基化的，DpnI 可以將原始野生型質(zhì)粒模板進(jìn)行酶切, 而質(zhì)粒擴(kuò)增的突變型質(zhì)粒不能被酶切從而保留下來。

4. *后，將酶切后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，通過涂板挑取單克隆菌落后，搖菌測(cè)序，這樣就可以得到突變基因的質(zhì)粒啦。

檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)

《化學(xué)品:體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)方法(GB/T 21793-2008)》