1 范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中維生素A、維生素E和維生素D的測(cè)定方法

本標(biāo)準(zhǔn)**法適用于食品中維生素A和維生素E的測(cè)定

本標(biāo)準(zhǔn)第二法適用于食用油、堅(jiān)果、豆類(lèi)和辣椒粉等食物中維生素E的測(cè)定。

本標(biāo)準(zhǔn)第三法適用于食品中維生素D2和維生素D的測(cè)定。

本標(biāo)準(zhǔn)第四法適用于配方食品中維生素D2或維生素D3的測(cè)定。

**法食品中維生素A和維生素E的測(cè)定反相高效液相色譜法

2 原理

試樣中的維生素A及維生素E經(jīng)皂化(含淀粉先用淀粉酶酶解)、提取、凈化、濃縮后,C3?；騊FP反相液相色譜柱分離,紫外檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器檢測(cè),外標(biāo)法定量。

3 試劑和材料

除非另有說(shuō)明,本方法所用試劑均為分析純,水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。

3.1 試劑

3.1.1 無(wú)水乙醇(C2H5OH):經(jīng)檢查不含醛類(lèi)物質(zhì),檢查方法參見(jiàn)A.1

3.1.2 抗壞血酸(C6H3O)

3.1.3 氫氧化鉀(KOH)。

3.1.4 乙醚[(CH3CH2)2O]:經(jīng)檢查不含過(guò)氧化物,檢查方法參見(jiàn)A.2

3.1.5 石油醚(C5H12O2):沸程為30℃~60℃。

3.1.6 無(wú)水硫酸鈉(Na2SO4)

3.1.7 pH試紙(pH范圍1~14)

3.1.8 甲醇(CH3OH):色譜純。

3.1.9 淀粉酶:活力單位≥100U/mg

3.1.10 2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(CH2O):簡(jiǎn)稱(chēng)BHT。

3.2 試劑配制

3.2.1 氫氧化鉀溶液(50g/100g):稱(chēng)取50g氫氧化鉀,加入50mL水溶解,冷卻后,儲(chǔ)存于聚乙烯瓶中。

3.2.2 石油醚-乙醚溶液(1+1):量取200mL石油醚,加入200mL乙醚,混勻

3.2.3 有機(jī)系過(guò)濾頭(孔徑為0.22m)

3.3 標(biāo)準(zhǔn)品

3.3.1 維生素A標(biāo)準(zhǔn)品 視黃醇(C20H3O,CAS號(hào):68-26-8):純度≥95%,或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

3.3.2 維生素E標(biāo)準(zhǔn)品

3.3.2.1 α生育酚(Ca3HO2,CAS號(hào):10191-41-0):純度≥95%,或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

3.3.2.2 β生育酚(C23H8O2,CAS號(hào):148-03-8):純度≥95%,或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

3.3.2.3 γ-生育酚(C2H3O2,CAS號(hào):54-28-4):純度≥95%,或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

3.32.4 δ生育酚(C27H46O2,CAS號(hào):119-13-1):純度≥95%,或經(jīng)國(guó)家認(rèn)證并授予標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

3.4.1 維生素Δ標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(0.500mg/mL):準(zhǔn)確稱(chēng)取25.0mg維生素A標(biāo)準(zhǔn)品,用無(wú)水乙醇溶解后,轉(zhuǎn)移入50mL容量瓶中,定容至刻度,此溶液濃度約為0.500mg/mL。將溶液轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶中,密封后,在一20℃下避光保存,有效期1個(gè)月。臨用前將溶液回溫至20℃,并進(jìn)行濃度校正(校正方法參見(jiàn)附錄B)

3.4.2 維生素E標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(1.00mg/mL):分別準(zhǔn)確稱(chēng)取a生育酚、B生育酚、y生育酚和生育酚各50.0mg,用無(wú)水乙醇溶解后,轉(zhuǎn)移亼50mL容量瓶中,定容至刻度,此溶液濃度約為1.00mg/mL。將溶液轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶中,密封后,在-20℃下避光保存,有效期6個(gè)月。臨用前將溶液冋溫至20℃,并進(jìn)行濃度校正(校正方法參見(jiàn)附錄B)。

3.4.3 維生素A和維生素E混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液:準(zhǔn)確吸取維生素A標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1.00m和維生素E標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各5.00mL于同一50mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,此溶液中維生素A濃度為10.0g/mL,維生素E各生育酚濃度為100μg/mL。在-20℃下避光保存,有效期半個(gè)月

3.4.4 維生素A和維生素E標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液:分別準(zhǔn)確吸取維生素A和維生素E混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中間液0.20mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、4.00mL、6.00mL于10mL棕色容量瓶中,用甲醇定容至刻度,該標(biāo)準(zhǔn)系列中維生素A濃度為0.20μg/mL、0.50μg/m、1.00μg/mL、2.00μg/mL、4.00μg/mL、6.00μg/mL,維生素E濃度為2.00μg/m、5.00μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL、60.0μg/mL。臨用前配制。

4 儀器和設(shè)備

4.1 分析天平:感量為0.01mg

4.2 恒溫水浴振蕩器

4.3 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

4.4 氮吹儀

4.5 紫外分光光度計(jì)。

4.6 分液漏斗萃取凈化振蕩器

4.7 高效液相色譜儀:帶紫外檢測(cè)器或二*管陣列檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器。

5 分析步驟

5.1 試樣制備

將一定數(shù)量的樣品按要求經(jīng)過(guò)縮分、粉碎均質(zhì)后,儲(chǔ)存于樣品瓶中,避光冷藏,盡快測(cè)定

5.2 試樣處理

警示:使用的所有器皿不得含有氧化性物質(zhì);分液漏斗活塞玻璃表面不得涂油;處理過(guò)程應(yīng)避免紫外光照,盡可能避光操作;提取過(guò)程應(yīng)在通風(fēng)柜中操作

5.2.1 皂化

5.2.1.1 不含淀粉樣品

稱(chēng)取2g~5g(精確至0.01g)經(jīng)均質(zhì)處理的固體試樣或50g(精確至0.01g)液體試樣于150mL平底燒瓶中,固體試樣需加入約20mL溫水,混勻,再加入1.0g抗壞血酸和0.1gBHT,混勻,加入30mL無(wú)水乙醇,加廴10mL~20mL氫氧化鉀溶液,邊加邊振搖,混勻后于80℃恒溫水浴震蕩皂化30min,皂化后立即用冷水冷卻至室溫

注:皂化時(shí)間一般為30min,如皂化液冷卻后,液面有浮油,需要加人適量氫氧化鉀溶液,并適當(dāng)延長(zhǎng)皂化時(shí)間。

5.2.1.2 含淀粉樣品

稱(chēng)取2g~5g(精確至0.01g)經(jīng)均質(zhì)處理的固體試樣或50g(精確至0.01g)液體樣品于150mL平底燒瓶中,固體試樣需用約20mL溫水混勻,加入0.5g~1g淀粉酶,放入60℃水浴避光恒溫振蕩30min后,取出,向酶解液中加入1.0g抗壞血酸和0.1gBHT,混勻,加入30mL無(wú)水乙醇,10mL

20mL氫氧化鉀溶液,邊加邊振搖,混勻后于80℃恒溫水浴振蕩皂化30min,皂化后立即用冷水冷卻至室溫。

5.2.2 提取

將皂化液用30mL水轉(zhuǎn)入250mL的分液漏斗中,加入50mL石油醚-乙醚混合液,振蕩萃取5min,將下層溶液轉(zhuǎn)移至另一250mL的分液漏斗中,加入50mL的混合醚液再次萃取,合并醚層。

注:如只測(cè)維生素A與α-生育酚,可用石油醚作提取劑。

5.2.3 洗滌

用約100mL水洗滌醚層,約需重復(fù)3次,直至將醚層洗至中性(可用pH試紙檢測(cè)下層溶液pH值),去除下層水相。

5.24 濃縮

將洗滌后的醚層經(jīng)無(wú)水硫酸鈉(約3g)濾250mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶或氮?dú)鉂饪s管中,用約15mL石油瞇沖洗分液漏斗及無(wú)水硫酸鈉2次,并入蒸發(fā)瓶?jī)?nèi),并將其接在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀或氣體濃縮儀上,于40℃水浴中減壓蒸餾或氣流濃縮,待瓶中醚液剩下約2mL時(shí),取下蒸發(fā)瓶,立即用氮?dú)獯抵两?。用甲醇分次將蒸發(fā)瓶中殘留物溶解并轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶中,定容至刻度。溶液過(guò)0.22μm有機(jī)系濾膜后供高效液相色譜測(cè)定

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