1 范圍

本標準規定了用氨基酸分析儀(茚三酮柱后衍生離子交換色譜儀)測定食品中氨基酸的方法。

本標準適用于食品中酸水解氨基酸的測定,包括天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸和精氨酸共16種氨基酸

2 原理

食品中的蛋白質經鹽酸水解成為游離氨基酸,經離子交換柱分離后,與茚三酮溶液產生顏色反應,再通過可見光分光光度檢測器測定氨基酸含量。

3 試劑和材料

除非另有說明,本方法所用試劑均為分析純,水為GB/T6682中規定的一級水。

3.1 試劑

3.1.1 鹽酸(HCl):濃度≥36%,優級純

3.1.2 苯酚(C6HOH)

3.1.3 氮氣:純度99.9%。

3.1.4 檸檬酸鈉(Na3C6H:O;·2H2O):優級純。

3.1.5 氫氧化鈉(NaOH):優級純。

3.2 試劑配制

3.2.1 鹽酸溶液(6mol/L):取500mL鹽酸加水稀釋至1000mL,混勻。

3.2.2 冷凍劑:市售食鹽與冰塊按質量1:3混合

3.2.3 氫氧化鈉溶液(500g/L):稱取50g氫氧化鈉,溶于50mL水中,冷卻至室溫后,用水稀釋至100mL,混勻。

3.2.4 檸檬酸鈉緩沖溶液[c(Naˉ)=0.2mo/L]:稱取19.6g檸檬酸鈉加入500m水溶解,加入16.5mL鹽酸,用水稀釋至1000mL,混勻,用6mol/L鹽酸溶液或500g/L氫氧化鈉溶液調節pH至2.2

3.2.5 不同pH和離子強度的洗脫用緩沖溶液:參照儀器說明書配制或購買

3.2.6 茚三酮溶液:參照儀器說明書配制或購買。

3.3 標準品

3.3.1 混合氨基酸標準溶液:經國家認證并授予標準物質證書的標準溶液。

3.3.2 16種單個氨基酸標準品:固體,純度≥98%。

3.4 標準溶液配制

34.1 混合氨基酸標準儲備液(1μmol/mL):分別準確稱取單個氨基酸標準品(精確至0.000011g)于同一5omL燒杯中,用8.3mL6mol/L鹽酸溶液溶解,精確轉移至250mL容量瓶中,用水稀釋定容至刻度,混勻(各氨基酸標準品稱量質量參考值見表1)。

3.4.2 混合氨基酸標準工作液(l00nmol/mL):準確吸取混合氨基酸標準儲備液1.0mL于10mL容量瓶中,加pH2.2檸檬酸鈉緩沖溶液定容至刻度,混勻,為標準上機液。

4 儀器和設備

4.1 實驗室用組織粉碎機或研磨機。

4.2 勻漿機

4.3 分析天平:感量分別為0.0001g和0.0001g。

4.4 水解管:耐壓螺蓋玻璃試管或安瓿瓶,體積為20mL~30mL。

4.5 真空泵:排氣量≥40L/min。

4.6 酒精噴燈。

4.7 電熱鼓風恒溫箱或水解爐。

4.8 試管濃縮儀或平行蒸發儀(附帶配套15mL~25mL試管)

4.9 氨基酸分析儀:茚三酮柱后衍生離子交換色譜儀。

5 分析步驟

5.1 試樣制備

固體或半固體試樣使用組織粉碎機或硏磨機粉碎,液體試樣用勻漿機打成勻漿密封冷凍保存,分析用時將其解凍后使用

5.2 試樣稱量

均勻性好的樣品,如奶粉等,準確稱取一定量試樣(精確至0.0001g),使試樣中蛋白質含量在10mg~20mg范圍內。對于蛋白質含量未知的樣品,可先測定樣品中蛋白質含量。將稱量好的樣品置于水解管中很難獲得高均勻性的試樣,如鮮肉等,為減少誤差可適當增大稱樣量,測定前再做稀釋。

對于蛋白質含量低的樣品,如蔬菜、水果、飲料和淀粉類食品等,固體或半固體試樣稱樣量不大于2g,液體試樣稱樣量不大于5g。

5.3 試樣水解

根據試樣的蛋白質含量,在水解管內加10mL~15mL6mol/L鹽酸溶液。對于含水量高、蛋白質含量低的試樣,如飲料、水果、蔬菜等,可先加入約相同體積的鹽酸混勻后,再用6mol/L鹽酸溶液補充至大約10mL。繼續向水解管內加入苯酚3滴~4滴。

將水解管放入冷凍劑中,冷凍3min~5min,接到真空泵的抽氣管上,抽真空(接近0Pa),然后充入氮氣,重復抽真空-充入氮氣3次后,在充氮氣狀態下封口或擰緊螺絲蓋。

將已封口的水解管放在110℃±1℃的電熱鼓風恒溫箱或水解爐內,水解22h后,取出,冷卻至室溫。

打開水解管,將水解液過濾至50mL容量瓶內,用少量水多次沖洗水解管,水洗液移入同一50mL容量瓶內,*后用水定容至刻度,振蕩混勻。

準確吸取1.0mL濾液移人到15mL或25mL試管內,用試管濃縮儀或平行蒸發儀在40℃~50℃加熱環境下減壓干燥,干燥后殘留物用1mL~2mL水溶解,再減壓干燥,*后蒸干用1.0mL~2.0mL pH2.2檸檬酸鈉緩沖溶液加入到干燥后試管內溶解,振蕩混勻后,吸取溶液通過0.22m濾膜后,轉移至儀器進樣瓶,為樣品測定液,供儀器測定用。

5.4 測定

5.4.1 儀器條件

使用混合氨基酸標準工作液注入氨基酸自動分析儀,參照JG1064-2011氨基酸分析儀檢定規程及儀器說明書,適當調整儀器操作程序及參數和洗脫用緩沖溶液試劑配比,確認儀器操作條件

5.4.2 色譜參考條件

a) 色譜柱:磺酸型陽離子樹脂;

b) 檢測波長:570nm和440nm。

5.4.3 試樣的測定

混合氨基酸標準工作液和樣品測定液分別以相同體積注入氨基酸分析儀,以外標法通過峰面積計算樣品測定液中氨基酸的濃度。

6分析結果的表述

6.1 混合氨基酸標準儲備液中各氨基酸濃度的計算各氨基酸標準品稱量質量參考值見表1。

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下載地址：《GB 5009.124-2016 食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》