硝 基 呋 喃 類 藥 物 (Nitrofuran antibiotics) 作 為一類廣譜抗生素被廣泛應用于動物飼料和治療藥物中，由于硝基呋喃在治療動物腸胃病方面效果明顯，故被應用于南美白對蝦育苗環節。研究表明該類藥物可能誘導有機體基因突變且具有遺傳毒性，歐美等國已將其列為違禁藥物，我國也將其列為食品動物的禁用獸藥。硝基呋喃類藥物主要包括呋喃唑酮 (Furanzolidone)、呋喃西林(Nitrofurazone)、呋喃妥因 (Furantoin)、呋喃它酮 (Furaltadone)4 種，該類藥物在動物體內會迅速分解，其代謝物可與蛋白質緊密結合形成穩定殘留，因此目前通常以測定其代謝物的方式來說明硝基呋喃類藥物在動物體內的含量。

南美白對蝦是寧波市水產養殖主導產業之一，是寧波市水產品出口創匯的少數優勢品種，因此保證南美白對蝦的食用安全對于保障百姓身體健康和擴大出口至關重要。隨著百姓對食品安全問題的日益關注以及政府對水產品質量安全監管的重視，水產苗種作為水產養殖業重要的投入品，它的安全關系到水產品安全問題的源頭，也是各級漁業行政主管部門主抓的工作之一，因此測定南美白對蝦苗中的硝基呋喃類抗生素代謝物有重要意義。

近年來高效液相色譜質譜聯用技術越來越多地應用于硝基呋喃類代謝物殘留的測定，與高效液相色譜紫外檢測器法比較，質譜檢測技術采用多反應監測 (MRM) 模式，結合液相保留時間及 MRM 特征離子對進行定性和定量分析，可以大大減少由于保留時間相同而待測離子不同所帶來的干擾，并且提高了檢測靈敏度，尤其適合于基質復雜樣品的分析，將這一技術應用于南美白對蝦苗種硝基呋喃類代謝物殘留測定，將有利于漁業行政主管部門對水產苗種企業的監管和水產品質量安全的提升。目前尚無高效液相色譜 – 串聯質譜法 (HPLC–MS／MS) 測定南美白對蝦苗種中硝基呋喃類抗生素代謝物的相關報道。確定了實驗條件，所建方法測定結果的精密度和準確度滿足藥物殘留檢測要求。

1實驗部分

1．1主要儀器與試劑

高 效 液 相 色 譜 – 質 譜 聯 用 儀：Waters 2695–Quattro micro mass 型，美國 Waters 公司；

超聲波清洗機：KS–120D 型，寧波科生公司；均質機：DJ– Ⅱ型，上海炳隆機電公司；

漩渦混勻儀：MS3 數顯型，德國 IKA 公司；恒溫水浴搖床：SHA–C 型，常州國華公司；

臺式離心機：DL–8M 型，上海離心機械研究所；旋轉蒸發儀：R215 型，瑞士 BUCHI 公司；

分析天平：BP211D Ma 型，感量為 0.000 1 g，德國 Sartorius 公司；

乙酸乙酯：分析純；乙腈、甲酸、2- 硝基苯甲醛：色譜純；鹽酸溶液：0.2 mol／L ；氫氧化鈉溶液：2.0 mol／L。

1．2標準溶液配制

AOZ，AMOZ，SEM · HCl，AHD · HCl 標準物質：純度不低于 98% ；同位素內標溶液：AOZ-D4，AMOZ-D5，AHD-13C3和 SEM · HCl-13C-15N2，質量濃度均為 100 μg／mL ；AOZ，AMOZ，SEM，AHD 標準儲備溶液：質量濃度均為 1.0 mg／mL，分別準確稱取一定量 AOZ，AMOZ，SEM，AHD，用甲醇溶解并分別定容至10mL棕色容量瓶中，4℃冷藏保存；混合標準工作溶液：準確吸取 AOZ，AMOZ,SEM,AHD標準儲備溶液，用流動相[乙腈–甲酸緩沖溶液（體積比20∶80）]逐級稀釋配制成100 ng／mL和10 ng／mL混合溶液，于4℃冷藏保存；混合內標工作溶液：準確吸取同位素內標溶液，用甲醇逐級稀釋配成 50 ng／mL 混合溶液，于4℃冷藏保存。

1．3樣品采集

南美白對蝦苗及對應苗池水樣品取自2007～2011 年每年 4～5 月間，樣品采集覆蓋了寧波市慈溪、寧海、象山、鄞州、奉化等南美白對蝦苗主要生產區，涵蓋了寧波市大型育苗場的 95%，抽取苗種規格均為 0.7～1.0 cm 仔蝦。

1．4樣品前處理

取南美白對蝦苗樣用均質機制成均質糜樣備用，稱 取 樣 品 2.0 g( 精 確 到 0.01 g) 于 50 mL 離心管中，加入 200 μL 混合內標工作溶液，再加入10 mL 0.2 mol／L 鹽 酸 溶 液 和 100 μL 2- 硝 基 苯甲醛，渦旋振蕩 50 s 后，置于恒溫水浴振蕩器中37℃避光振蕩 16 h。取出離心管冷卻至室溫，加入1.0 mol／L 氫氧化鈉溶液約 2.0 mL，再調節 pH 至7.0～7.5，加入 10 mL 乙酸乙酯，渦旋振蕩 50 s，以4 000 r／min 離心 5 min，取上層清液轉移至 50 mL旋轉蒸發瓶中，再加入 10 mL 乙酸乙酯，重復上述操作，合并上清液旋轉蒸發至干，準確加入 1.0 mL乙腈 – 甲酸緩沖溶液（體積比 20∶80），渦旋振蕩溶解殘留物，過 0.45 μm 濾膜，待測。標準工作曲線制作時，用 100 ng／mL 和 10 ng／mL 混合標準工作液配制系列標準使用液，不加樣品，其余等同樣品前處理過程。

1．5儀器工作條件

1.5.1色譜條件

色譜柱：SHISEIDO MG Ⅲ C18 柱 (2.0 mm×100mm) ；流動相：乙腈 – 甲酸緩沖溶液 ( 體積比20∶80），梯度洗脫流速為0.2 mL／min；柱溫：30℃；進樣體積：10 μL；進樣時間：20 min。

1.5.2質譜條件

離子化模式：大氣壓電噴霧離子源（ESI），正離子模式；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣流：600 L／h ；掃描模式：選擇反應監測模式；選擇反應監測母離子、子離子和碰撞能量。

2結果與分析

2．1衍生化時間對回收率的影響

衍生化時間的設定對樣品測定結果有很大影響，實驗發現衍生化時間超過 12 h后，AOZ，SEM 回 收 率 較 好 且 穩 定，而 AMOZ，AHD 衍生時間達到 16 h 才有穩定的回收率。當衍生時間小于 12 h 時，4 種硝基呋喃類代謝物不能保證每次都衍生完全，盡管 AOZ 在衍生化 6 h就能有較好回收率，但回收率并不穩定，且并未隨時間的延長而呈比例增大。因此同時測定硝基呋喃 4 種代謝物時，應選擇衍生時間大于 16 h。

2．2色譜柱的選擇

考察了 Waters atlantis C18(2.1 mm×150 mm)柱和SHISEIDO MGⅢC 18(2.0 mm×100 mm)柱對待測物的分離效果，結果表明， SHISEIDOMGⅢC 18柱靈敏度高于waters atlantisC 18柱，而waters atlantisC18柱的穩定性較好，綜合考慮選擇SHISEIDO MGⅢC18柱。

2．3流動相的選擇

考察了甲醇 – 水、乙腈 – 水、乙腈 –2 mmol／L乙酸銨、乙腈 –1‰甲酸溶液等不同流動相對 4 種硝基呋喃代謝物的色譜行為和離子化程度的影響。結基呋喃代謝物的色譜行為和離子化程度的影響。結表明，以乙腈 –1‰甲酸溶液作為流動相時，可獲得*優的色譜分離效果和質譜信號響應。

2．4工作曲線方程、檢出限和定量限

配制質量濃度為 0.2～50 ng／mL 的系列標準溶液，按照樣品的前處理方法進行衍生化和提取后，利用高效液相色譜 – 串聯質譜進行測定。以色譜峰面積 (Y) 對被測組分的質量濃度 (X) 進行線性回歸，AOZ，AHD，SEM，AMOZ 的回歸方程和相關系數。在陰性樣品基質中添加 4 種標準溶液（AOZ，AMOZ 的 添 加 水 平 為 0.10 μg／kg，SEM，AHD 的添加水平為 0.25 μg／kg），當信噪比 (S／N)于 5 時，計算 AOZ，AMOZ 的檢出限為 0.10 μg／kg，SEM，AHD 的檢出限為 0.25 μg／kg。在陰性樣品基質中添加 4 種標準溶液（AOZ，AMOZ 的添加水平為 0.40 μg／kg，SEM，AHD 的添加水平為 0.50μg／kg），當 信 噪 比 (S／N) 大 于 10 時 計 算 AOZ，AMOZ 的定量下限為 0.40 μg／kg，SEM，AHD 的定量下限為 0.50 μg／kg。

2．5方法回收率和精密度試驗

選取陰性樣品，添加 4 種硝基呋喃類代謝物標準品和相應內標，添加水平為 2.50，10.0 μg／kg，每個水平做 6 個平行加標回收試驗，加標回收率為 88.2％～97.6％，相對標準偏差為 4.6％～6.8％，由此可見方法的精密度和準確度較高。

3結語

采用液相色譜串聯質譜技術建立了南美白對蝦苗的硝基呋喃類代謝物測定方法，對樣品前處理的提取凈化條件、液相色譜分離條件和串聯質譜測定條件進行了優化。該方法具有穩定性好、靈敏度高的特點，其線性、準確度和精密度均能滿足藥物殘留測定要求。該方法樣品前處理過程簡單、凈化效果好，適合于大批量樣品的快速檢測，該研究為政府相關部門對南美白對蝦苗硝基呋喃類代謝物的監督提供了參考。

摘自化學分析計量