直接在臨床分離的多重耐藥菌中進(jìn)行功能基因組學(xué)研究是解析耐藥機(jī)制以及開(kāi)發(fā)抗耐藥策略*直接有效的方法。然而，由于缺乏能在臨床耐藥菌中直接進(jìn)行高效基因編輯的工具，目前耐藥機(jī)制仍主要是采用組學(xué)分析加在模式菌中的異源驗(yàn)證進(jìn)行研究。這種脫離了臨床耐藥菌本身遺傳背景的研究策略，往往忽略了遺傳背景本身對(duì)耐藥因子的影響以及不同耐藥因子之間的相互關(guān)系，很多時(shí)候無(wú)法對(duì)臨床抗耐藥研發(fā)提供真正有效的依據(jù)。開(kāi)發(fā)一種能與臨床菌復(fù)雜各異的基因型兼容、并且簡(jiǎn)便高效的基因組編輯方法將有助于打破這一研究壁壘。

中國(guó)科學(xué)院微生物研究所向華團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期從事微生物CRISPR-Cas系統(tǒng)分子機(jī)制的研究，在致力于開(kāi)發(fā)基因編輯新元件新機(jī)制的同時(shí)，近年來(lái)積*倡導(dǎo)利用原核微生物自身的CRISPR-Cas系統(tǒng)發(fā)展重要原核微生物基因組編輯技術(shù)，推動(dòng)對(duì)微生物世界生命機(jī)制更加深入系統(tǒng)的理解和開(kāi)發(fā)應(yīng)用。11月5日，向華團(tuán)隊(duì)和香港大學(xué)閆愛(ài)新團(tuán)隊(duì)聯(lián)合在Cell Reports上發(fā)表了題為Native CRISPR-Cas-Mediated Genome Editing Enables Dissecting and Sensitizing Clinical Multidrug-Resistant P. aeruginosa 的文章。作者以多重耐藥研究中*重要的標(biāo)準(zhǔn)參照病原菌銅綠假單胞菌作為研究對(duì)象，報(bào)道了在臨床多重耐藥銅綠假單胞菌中開(kāi)發(fā)基于內(nèi)源性I-F型CRISPR的、高效簡(jiǎn)便的基因編輯系統(tǒng)，并在該系統(tǒng)的輔助下，實(shí)現(xiàn)了在臨床多重耐藥菌株自身遺傳背景下耐藥機(jī)制的原位解析和抗耐藥化合物的篩選。

銅綠假單胞菌是當(dāng)前亟需關(guān)注的七種病原細(xì)菌“ESKAPE”（腸球菌屬，金黃色葡萄球菌，克雷伯菌，鮑曼不動(dòng)桿菌，銅綠假單胞菌和腸桿菌屬）之一。由于該病原菌*易產(chǎn)生多重耐藥性，現(xiàn)有的抗生素療法不僅不能有效地根治其感染，阻止耐藥性的傳播，還會(huì)破壞宿主的益生菌群，對(duì)人體健康產(chǎn)生*大的副作用。早先，閆愛(ài)新團(tuán)隊(duì)對(duì)2015-2016年香港瑪麗醫(yī)院各種感染性疾病包括傷口、尿道、耳部、膿液、引流液及血液感染的患者中分離的銅綠假單胞菌進(jìn)行了耐藥檢測(cè)并報(bào)道了一株有潛在流行性特征的多重耐藥菌PA154197。然而，研究人員嘗試了傳統(tǒng)的雙交換同源重組策略和基于外源Cas9的雙載體編輯系統(tǒng)均未能實(shí)現(xiàn)對(duì)該菌株基因組的編輯，這嚴(yán)重阻礙了對(duì)其耐藥性機(jī)制的深入解析。全基因組測(cè)序結(jié)果顯示PA154197含有1個(gè)完整的內(nèi)源性I-F型CRISPR-Cas系統(tǒng)。他們通過(guò)與向華團(tuán)隊(duì)合作，基于該系統(tǒng)共同開(kāi)發(fā)出了一套具有抗性基因和報(bào)告基因雙篩選標(biāo)記的單質(zhì)粒基因編輯系統(tǒng)。該系統(tǒng)包含一個(gè)由強(qiáng)啟動(dòng)子（Ptat）驅(qū)動(dòng)的mini-CRISPR元件（用于表達(dá)crRNA）和luminescence報(bào)告基因（luxCDABE）（用于輔助陽(yáng)性克隆篩選），并同時(shí)含有同源重組的donor片段和用于克隆篩選的卡那霉素抗性基因。通過(guò)電轉(zhuǎn)法將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入PA154197后，研究人員通過(guò)對(duì)具有明顯熒光信號(hào)的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行進(jìn)一步PCR及測(cè)序驗(yàn)證，能夠快速（一周以?xún)?nèi)）獲得陽(yáng)性克隆，并同時(shí)實(shí)現(xiàn)了對(duì)其基因組高效、多樣化的精準(zhǔn)編輯（包括基因敲除、DNA插入和定點(diǎn)突變等）。值得一提的是，基于熒光信號(hào)的陽(yáng)性克隆初篩策略巧妙地規(guī)避了耐藥菌在抗生素篩選下假陽(yáng)性率高的難題，大大降低了克隆篩選的工作量。進(jìn)一步的研究表明這一系統(tǒng)也適用于其它含有I-F型CRISPR的環(huán)境和臨床銅綠假單胞菌株，如分離自北太平洋的Ocean-100和另一株臨床菌株P(guān)A150567。基于這套高效的基因編輯系統(tǒng)和前期的基因組與轉(zhuǎn)錄組分析，研究人員構(gòu)建了一系列突變菌株并揭示了PA154197中三個(gè)關(guān)鍵的耐藥突變（mexR：T226G； mexT：8bp 缺失；gyrA：T248C）以及它們之間顯著的協(xié)同關(guān)系。隨后利用這一系列突變菌株對(duì)多種抗菌化合物進(jìn)行了耐藥性檢測(cè)，研究人員發(fā)現(xiàn)該耐藥菌對(duì)陽(yáng)離子擬肽類(lèi)小分子（Small Cationic Peptidomimetics）與多種抗生素表現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)的伴隨性敏感現(xiàn)象（Collateral Sensitivity），并且該伴隨性敏感現(xiàn)象主要依賴(lài)于其中的一個(gè)耐藥突變（mexT）。*后研究人員證明了陽(yáng)離子擬態(tài)類(lèi)小分子通過(guò)作用于耐藥菌的外膜從而能夠顯著提高該耐藥菌對(duì)抗生素的敏感性，以及陽(yáng)離子擬態(tài)類(lèi)小分子與抗生素的聯(lián)用能夠有效地抑制耐藥菌的生長(zhǎng)并對(duì)耐藥菌有特異高效的殺滅效果。

該研究首次利用內(nèi)源性I-F型CRISPR系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)多重耐藥菌的基因編輯，由于I-F型CRISPR系統(tǒng)普遍存在于多重耐藥的銅綠假單胞菌中（70%），這將為臨床耐藥菌的研究提供高效、簡(jiǎn)便的基因編輯方法和一種原位耐藥性解析的新策略。此外，該研究對(duì)臨床多重耐藥菌的耐藥機(jī)理進(jìn)行了解析并發(fā)現(xiàn)了該菌對(duì)陽(yáng)離子擬態(tài)類(lèi)小分子的伴隨性敏感現(xiàn)象。這一新發(fā)現(xiàn)將為解決臨床抗耐藥應(yīng)用提供新的思路和手段。