1.范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了嬰幼兒食品和乳品中維生素B2的測定方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于嬰幼兒食品和乳品中維生素B2的測定。

2.規(guī)范性引用文件

本標(biāo)準(zhǔn)中引用的文件對于本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,僅所注日期的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件,其*新版本(包括所有的修改單)適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

3.原理

試樣在稀鹽酸環(huán)境中恒溫水解,酶解,經(jīng)C1s反相色譜柱分離,用熒光檢測器(EX:462nm,Em：522nm)檢測,外標(biāo)法定量。

4.試劑和材料

除非另有規(guī)定,本方法所用試劑均為分析純,水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。

4.1 鹽酸。

4.2 三水乙酸鈉。

4.3 冰乙酸。

4.4 甲醇:色譜純。

4.5 維生素B2(核黃素)標(biāo)準(zhǔn)品:純度≥99%。

4.6 鹽酸(1+1):量取100mL鹽酸(4.1)緩慢倒入100mL水中,混勻。

4.7 鹽酸(0.1mol/L):吸取9mL鹽酸(4.1),溶于1000mnL水中。

4.8 鹽酸(0.01mol/L):吸取0.1 mol/L鹽酸(4.7)50mL,用水稀釋并定容至500mL。

4.9 乙酸鈉溶液(0.05mol/L):稱取6.80g三水乙酸鈉(4.2),加900mL水溶解,用冰乙酸調(diào)pH值至4.0～5.0,用水定容至1000mL。經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾。

4.10 乙酸鈉溶液(2.0mol/L):稱取27.22g三水乙酸鈉(4.2),用水溶解并定容至100mL。

4.11 混合酶溶液:稱取2.345g木瓜蛋白酶(活力單位≥600U/g)、1.175g淀粉酶(活力單位≥4000U/g)和1.000g酸性磷酸酶(活力單位≥4000U/g),用水定容至50mL。臨用前配制。

4.12 標(biāo)準(zhǔn)溶液

4.12.1 維生素B2標(biāo)準(zhǔn)儲備液(250μg/mL):稱取25mg(精確至0.1mg)維生素B2標(biāo)準(zhǔn)品(4.5),加入鹽酸(4.6)2mL,超聲溶解后,立即用水轉(zhuǎn)移并定容至100mL。置于棕色玻璃容器中在0℃～4℃冰箱貯存,保存期為3個月。

4.12.2 維生素B2標(biāo)準(zhǔn)中間液:準(zhǔn)確吸取4.00mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液(4.12.1),用水稀釋并定容至100mL,此溶液中維生素B2濃度為10μg/mL。臨用前配制。

4.12.3 維生素B2標(biāo)準(zhǔn)系列工作液:分別吸取維生素B2標(biāo)準(zhǔn)中間液(4.12.2)0.00mL、0.50mL、1.00mL、2.00mL、5.00mL、l0.00mL,用水溶解并定容至100mL。該標(biāo)準(zhǔn)系列濃度分別為0.00μg/mL、0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL。臨用前配制。

5.儀器和設(shè)備

5.1 高效液相色譜儀,帶有熒光檢測器。

5.2 高壓滅菌鍋。

5.3 pH計:精度為0.01。

5.4 組織搗碎機。

5.5 0.45μm微孔水相濾膜。

5.6 天平:感量1mg和0.1mg。

6.分析步驟

6.1 試樣的處理

稱取5g～10g(精確至0.01g)試樣(如有必要,將試樣放入搗碎機中搗碎;試樣中含維生素B2 5μg以上)于100mL三角瓶中,加60mL0.1mol/L鹽酸(4.7),充分搖勻,用棉花塞和牛皮紙封口,放入髙壓滅菌鍋內(nèi),在121℃下保持30min,待冷卻至40℃以下后取出,輕搖數(shù)次;用2.0mol/L乙酸鈉溶液(4.10)調(diào)pH值至4.0左右,加入2.0mL混合酶溶液(4.11),搖勻后,置于37℃培養(yǎng)箱中過夜;將酶解液轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中,用水定容至刻度,用定量濾紙過濾,取濾液再經(jīng)0.45μm濾膜(5.5)過濾,取濾液備用。

注:操作過程應(yīng)避免強光照射。

6.2 測定

6.2.1 參考色譜條件

色譜柱:C18反相色譜柱(粒徑5μm,250mm×4.6mm)或同等性能的色譜柱。

流動相:0.05mol/L乙酸鈉溶液(4.9)一甲醇(4.4)=65+35。

流速:1.0 mL/min。

檢測波長:激發(fā)波長462nm,發(fā)射波長522nm。

進樣量:20μL。

6.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將維生素B2標(biāo)準(zhǔn)系列工作液(4.12.3)依次進行色譜測定(其標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖參見附錄A中圖A.1),記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

6.2.3 試液測定

將試液進行色譜測定,從標(biāo)準(zhǔn)曲線中査得試液相應(yīng)的濃度。

更多標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容點擊以下鏈接獲取標(biāo)準(zhǔn)全文：

下載地址：《GB 5413.12-2010 嬰幼兒食品和乳品中維生素B2的測定》