1.范圍

本標準規定了一種采用高效液相色譜法同時測定大豆中磷脂中磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇三種組分含量的方法。

本標準適用于含油大豆磷脂、脫油大豆磷脂中磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的測定。本標準不適用于大豆溶血磷脂酰膽堿及大豆溶血磷脂酰乙醇胺的測定。

本標準中磷脂酰膽堿的檢測限為1.21×10-2mg/mL,磷脂酰乙醇胺的檢出限為4.63×10-2mg/mL,磷脂酰肌醇的檢出限為7.36×10-3mg/mL。

2.原理

用多元流動相等度洗脫分配與色譜柱兩相中的磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇組分,在固定相中滯留時

間不同，達到分離目的。紫外檢測器在線檢測流出組分,與標準系列比較定量。

3.試劑

3.1 正己烷：色譜純。

3.2 異丙醇：色譜純。

3.3 水:色譜純。

3.4 冰醋酸:色譜純。

3.5 1%冰醋酸溶液：1mL冰醋酸用色譜純水定容到100mL。

3.6 磷脂酰膽堿：標準物質，純度≥99%。

3.7 磷脂酰乙醇胺：標準物質，純度≥99%。

3.8 磷脂酰肌醇：標準物質，純度≥98%。

3.9 流動相:V(正己烷)+V(異丙醇)+V(1%冰醋酸溶液)=8+8+1。

注：所用的磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇標樣來源應與所測定的樣品一致，如測定的樣品為大豆磷脂時，上述三種標樣應來源于大豆。

4.儀器與設備

4.1 分析天平:精度為0.0001g。

4.2 刻度吸管:0.5mL,1mL，5mL。

4.3 容量瓶:5mL,10mL,100mL。

4.4 量筒:100mL,500mL,1000mL。

4.5 氮氣瓶

4.6 液相色譜儀,帶進樣系統、紫外檢測器和數據處理器。

4.7 液相色譜柱：Si-60柱子,填料粒度為5μm。長度250mm,內徑4.6mm。

注:柱子長度與直徑可以依據實驗條件做相應選擇。

5.分析步驟

5.1 液相系統的平衡

進樣分析前,用流動相平衡液相系統,控制流速為0.5mL/min,保證基線平穩,樣品的保留時間穩定。

5.2 標準溶液的配制

精確稱取約20mg磷脂酰膽堿、20mg磷脂酰乙醇胺與10mg磷脂酰肌醇,用V(正己烷)+V(異丙醇)+V(1%冰醋酸溶液)=8+8+1混合溶劑溶解并定容到10mL,配制磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的混合標準溶液,使溶液中磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇濃度分別為2mg/mL、2mg/mL、1mg/mL。準確吸取此溶液0.25mL、1.25mL、2.50mL、3.75mL,5.00mL,并用V(正己烷)+V(異丙醇)+V(1%冰醋酸溶液)=8+8+1混合溶劑定容到5mL,使溶液中磷脂酰膽堿的*終濃度為0.1mg/mL～2.0mg/mL,磷脂酰乙醇胺的*終濃度為0.1mg/mL～2.0mg/mL,磷脂酰肌醇的*終濃度為0.05mg/mL～1.0mg/mL,低于-16℃保存備用,保存時注意容器口的密封。

注:假如標樣為三氧甲烷或甲醇的溶液,必須將其中的溶劑用氮氣小心吹干,再用流動相溶解定容。

5.3 標準工作曲線的制作

分別取不同濃度的磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇混合標準溶液10μL注入液相色譜中。以樣品各組分濃度為橫坐標,各組分峰面積為縱坐標,分別繪制磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇三種組分的標準工作曲線。

5.4 樣品前處理

測試樣品應避光放在密閉和防潮的容器內,樣品在使用前需充分混勻。

依據樣品中磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇含量,精確稱取樣品15mg～50mg,用V(正己烷)+V(異丙醇)+V(1%冰醋酸溶液)=8+8+1混合溶劑溶解并定容至5mL,低于-16℃保存備用,保存時注意容器口的密封。

5.5 測定

5.5.1 色譜條件：Si60柱子,長250mm,內徑4.6mm,填充物粒度5μm,流動相流速1mL/min,柱溫30℃,紫外檢測波長205mm。如果采用不同型號的Si柱,可通過調整流速,達到*佳工作狀態。

5.5.2 進樣:準確取經0.45μm微孔過濾的待測液10μL,注入液相色譜儀,比較待測液與標準樣品的高效液相色譜(HPLC)圖譜,取與標準樣品HPLC圖譜中磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰膽堿相同時間的峰面積與標準工作曲線比較定量。對同一樣品至少進行兩次測定。

6.結果計算

試樣中磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷酯酰肌醇的含量以各組分的質量與試樣原有質量的質量分數表示,其計算公式為：

X=c×5/m×100

X——樣品中磷脂酰膽堿(或磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇)的含量,單位為克每一百克(g/100g);

c——由磷脂酰膽堿(或磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇)標準工作曲線上查出的試樣測定液中磷脂酰膽堿(或磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇)的濃度,單位為毫克每毫升(mg/mL);

5——樣品的定容體積,單位為毫升(mL);

m——樣品的總質量,單位為毫克(mg)。

如果兩次測定的結果符合第7章中給定的重復性要求,則取兩次測定的算術平均值作為結果,如果不符合重復性要求,需對同一樣品重新進行兩次測定。

7.重復性要求

同一個分析者使用同樣的方法在同一個實驗室內使用同樣儀器設備對同一試樣連續進行兩次測定的結果相對偏差不得大于5%。

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下載地址：《GB/T 21493-2008 大豆磷脂中的磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的測定》