支原體(Mycoplasma)屬于柔膜體綱，是介于細(xì)菌和病毒之間的一類(lèi)無(wú)細(xì)胞壁的原核細(xì)胞微生物，他們是已知*小的自我復(fù)制的原核生物。支原體細(xì)胞大小和形態(tài)存在差異，大小介于細(xì)菌和病毒之間，能夠透過(guò)一般濾膜（0.22μm），呈高度多形性，有球形、桿狀、絲狀、分枝狀等多種不能被革蘭氏染色，但可在瓊脂固體平板上形成“菌落”且可被甲基藍(lán)染色。支原體以寄生和共生方式存活，部分可能導(dǎo)致動(dòng)物、植物宿主的病變。對(duì)人致病的支原體主要有肺炎支原體、溶脲脲原體、人型支原體、生殖器支原體等。支原體是細(xì)胞污染物中比較常見(jiàn)的一種，細(xì)胞受支原體污染程度較輕時(shí)，不會(huì)表現(xiàn)出明顯的癥狀，但一旦這種潛伏的污染爆發(fā)時(shí)，細(xì)胞會(huì)大量脫落，細(xì)胞培養(yǎng)液會(huì)變渾濁。原代細(xì)胞和傳代細(xì)胞都可能遭受支原體污染，根據(jù)國(guó)外不同實(shí)驗(yàn)室的調(diào)查結(jié)果顯示，有15%-80%的細(xì)胞被支原體污染，傳代細(xì)胞的污染率高于原代細(xì)胞。

　　盡管自然界中存在的支原體有120多種，但污染細(xì)胞的支原體主要有5種，分別為牛源的萊氏無(wú)膽甾原體和精氨酸支原體，人源的口腔支原體和發(fā)酵支原體，豬源的豬鼻支原體，這5種支原體占所有支原體污染的95%以上。

　　支原體污染可能來(lái)自操作人員和細(xì)胞培養(yǎng)用原材料如血清和胰蛋白酶，也可能來(lái)自于本身已被污染的細(xì)胞系和毒種。細(xì)胞受支原體污染后，功能和活性都會(huì)受到影響，會(huì)帶來(lái)不可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和不安全的細(xì)胞制品，因此對(duì)細(xì)胞進(jìn)行支原體檢測(cè)十分關(guān)鍵。

　　支原體檢測(cè)相關(guān)法規(guī)概覽

　　支原體檢測(cè)屬于監(jiān)管要求的一部分，支原體檢測(cè)方法在全球范圍內(nèi)的一些藥典、法規(guī)和指導(dǎo)文件中均有說(shuō)明。傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法和指示細(xì)胞培養(yǎng)方法并非完全一致，可能會(huì)因不同監(jiān)管管轄區(qū)而有所不同。

　　針對(duì)生物制藥產(chǎn)品支原體檢測(cè)的檢測(cè)指導(dǎo)方針包括以下內(nèi)容：

　　?中國(guó)藥典2020版三部：生物制品生產(chǎn)檢定用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備及質(zhì)量控制

　　?中國(guó)藥典2020版三部：3301支原體檢查法

　　?歐洲藥典2.6.7：Mycoplasmas

　　?美國(guó)藥典<63>：MycoplasmaTests

　　?ICHQ5D:用于生產(chǎn)生物技術(shù)/生物產(chǎn)品的細(xì)胞底物的起源和特征描述

　　?CBER/FDA,Pointstoconsiderinthecharacterizationofcelllinesusedtoproducebiologicals（用于生產(chǎn)生物制品的細(xì)胞系檢定的考慮要點(diǎn)）(1993)

　　?CBER/FDA,Pointstoconsiderinthemanufacturingandtestingofmonoclonalantibodyproductsforhumanuse（在生產(chǎn)和檢測(cè)人用單克隆抗體產(chǎn)品時(shí)的考慮要點(diǎn)）(1997)

　　?FDA,GuidanceforIndustry:CharacterizationandQualificationofCellSubstratesandOtherBiologicalMaterialsUsedintheProductionofViralVaccinesforInfectiousDiseaseIndications（用于生產(chǎn)傳染病適應(yīng)癥病毒疫苗的細(xì)胞基質(zhì)和其他生物材料的檢定和驗(yàn)證）（2010年2月）

　　必須證明用于生物制品生產(chǎn)的細(xì)胞基質(zhì)不含外源因子，包括支原體。支原體污染檢測(cè)必須在產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的各個(gè)階段進(jìn)行，包括原材料、細(xì)胞庫(kù)(MCB+WCB+EOPC)、病毒種子庫(kù)、未加工的收獲液材料和*終產(chǎn)品。

　　據(jù)報(bào)道，螺原體在許多昆蟲(chóng)物種中是傳染源，昆蟲(chóng)細(xì)胞系也被報(bào)道在哺乳動(dòng)物中引起致病作用，建議對(duì)昆蟲(chóng)細(xì)胞或暴露于植物源性材料的細(xì)胞進(jìn)行螺原體檢測(cè)。還建議對(duì)接觸過(guò)植物或昆蟲(chóng)材料的生物制藥產(chǎn)品進(jìn)行螺旋體檢測(cè)。

　　哪些樣品需要進(jìn)行支原體檢測(cè)？

　　?生物源性材料：如豬胰酶、牛血清等（如作為生物制品生產(chǎn)用原材料）

　　?生產(chǎn)及檢定用細(xì)胞庫(kù)：MCBWCBEOPC

　　?抗體上清收獲液UPB

　　?病毒類(lèi)疫苗的病毒收獲液、原液

　　?臨床治療用細(xì)胞

　　?其他可能受支原體污染的材料、樣品等

　　支原體檢測(cè)方法

　　轉(zhuǎn)換支原體檢測(cè)方法既昂貴又耗時(shí)，因此在**時(shí)間選擇*佳方法有助于避免產(chǎn)品開(kāi)發(fā)、制造和放行的延誤。

　　美國(guó)藥典＜USP＞63中指出需要用兩種方法檢測(cè)支原體污染：（A）瓊脂－肉湯培養(yǎng)法（B）指示細(xì)胞法。并提到經(jīng)驗(yàn)證的核酸擴(kuò)增方法（NAT）或酶學(xué)方法可以用于檢測(cè)支原體，但前提是該方法經(jīng)驗(yàn)證可與培養(yǎng)法和指示細(xì)胞法等效。

　　歐洲藥典EP2.6.7中也要求培養(yǎng)法和指示細(xì)胞法同時(shí)檢測(cè)，并且更詳細(xì)的介紹了NAT方法代替前1或2種方法的具體驗(yàn)證要求。直接NAT法可以在有細(xì)胞毒性的材料中應(yīng)用或需要快速方法時(shí)使用。細(xì)胞培養(yǎng)富集后NAT方法適合于待檢樣品與指示細(xì)胞共培養(yǎng)一段時(shí)間后，從細(xì)胞和上清中提取核酸，再通過(guò)NAT檢測(cè)。

　　中國(guó)藥典3301指出主細(xì)胞庫(kù)、工作細(xì)胞庫(kù)、病毒種子批、對(duì)照細(xì)胞以及臨床治療用細(xì)胞進(jìn)行支原體檢查時(shí)，應(yīng)同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)法和指示細(xì)胞培養(yǎng)法（DNA染色法）。病毒類(lèi)疫苗的病毒收獲液、原液采用培養(yǎng)法檢查支原體；必要時(shí)，亦可釆用指示細(xì)胞培養(yǎng)法篩選培養(yǎng)基。也可采用經(jīng)國(guó)家藥品檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可的其他方法。

　　方法適用性

　　生長(zhǎng)抑制性物質(zhì)檢測(cè)

　　歐洲藥典和美國(guó)藥典中都提出了檢測(cè)支原體前需要對(duì)待檢樣品中的對(duì)支原體生長(zhǎng)起到抑制性的物質(zhì)（InhibitorySubstances）進(jìn)行判斷，即方法適用性驗(yàn)證。如果產(chǎn)品/樣品的生產(chǎn)方法存在變更可能影響支原體的檢測(cè)需要重新對(duì)樣品對(duì)支原體抑制性進(jìn)行檢測(cè)。

　　1.培養(yǎng)法

　　?檢測(cè)樣本直接接種到瓊脂平板以及液體培養(yǎng)基中。

　　?所選擇的瓊脂和液體培養(yǎng)基具有令人滿意的營(yíng)養(yǎng)特性，可支持多種支原體的生長(zhǎng)。

　　?每個(gè)支原體檢測(cè)分析中都包含陰性和陽(yáng)性對(duì)照，以檢查系統(tǒng)適用性。

　　?在培養(yǎng)期間，液體培養(yǎng)物在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)被傳代培養(yǎng)到瓊脂平板上，以觀察支原體的生長(zhǎng)。

　　?在培養(yǎng)期結(jié)束時(shí)，用顯微鏡檢查瓊脂平板上是否存在支原體菌落。

　　?總檢測(cè)時(shí)間為28天。

　　2.指示細(xì)胞法

　　有些挑剔的支原體菌株被稱(chēng)為“不可培養(yǎng)”，因?yàn)樗鼈儾荒茉谟糜谂囵B(yǎng)方法的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。Vero或NIH3T3細(xì)胞的培養(yǎng)物用于培養(yǎng)支原體。孵育一周后，將細(xì)胞固定，用DNA結(jié)合熒光染料染色，并在顯微鏡下進(jìn)行評(píng)估。

　　在支原體感染的情況下，當(dāng)污染嚴(yán)重時(shí)，細(xì)胞表面和周?chē)鷧^(qū)域會(huì)出現(xiàn)明亮熒光的特征模式。

　　3.qPCR方法

　　?特異性核酸擴(kuò)增及熒光探針技術(shù)：這種支原體檢測(cè)分析檢測(cè)特定核酸序列的存在，但不一定表明存在活支原體。

　　?肉湯培養(yǎng)基生長(zhǎng)富集和RT-PCR：這種測(cè)定包括核酸檢測(cè)前的生長(zhǎng)富集步驟，以從非活菌和殘留環(huán)境源中區(qū)分活菌。樣本在第0天和第7天進(jìn)行檢測(cè)。

　　?細(xì)胞共培養(yǎng)生長(zhǎng)富集和RT-PCR：這種支原體檢測(cè)方法包括核酸檢測(cè)前的生長(zhǎng)富集步驟，以從非活菌和殘留環(huán)境源中區(qū)分活菌。樣本在第0天和第5天從細(xì)胞共培養(yǎng)中進(jìn)行檢測(cè)。

　　?螺原體檢測(cè)：這種測(cè)定包括核酸檢測(cè)前的生長(zhǎng)富集步驟，以從非活菌和殘留環(huán)境源中區(qū)分活菌。樣本在第0天和第7天進(jìn)行檢測(cè)。

　　盡管PCR檢測(cè)更常用于支原體檢測(cè)，但監(jiān)管機(jī)構(gòu)并未普遍批準(zhǔn)基于PCR的支原體檢測(cè)。可以使用PCR作為過(guò)程控制和產(chǎn)品特定驗(yàn)證的補(bǔ)充方法；但是，需要對(duì)傳統(tǒng)方法進(jìn)行可比性研究，以證明這些方法是等效的。PCR法檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較短、廣譜性強(qiáng)。雖然PCR法檢測(cè)快速靈敏，但是，也有一些研究指出，PCR方法也存在可能的問(wèn)題：（1）支原體的特異性引物與衣原體具有同源性，會(huì)使PCR檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性。（2）細(xì)胞培養(yǎng)幾天后，培養(yǎng)液中會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重抑制PCR擴(kuò)增的代謝物，所以樣品前處理是PCR法不可或缺的一個(gè)環(huán)節(jié)。（3）靈敏度有限，通常需要將培養(yǎng)液離心濃縮或者提取DNA后檢測(cè)。