米酵菌酸，化學名為：3-羧甲基-17-甲氧基-6，18，21-三甲基-廿二碳-2，4，8，12，14，18-七烯二酸。

20世紀30年代國外從引起人中毒的椰子發酵食品樣品中提取出該毒素，并對該毒素的理化性質和致毒機制進行了大量研究，近年來米酵菌酸又作為研究抗腫瘤疾病和細胞凋亡的一種工具試劑來使用。我國70年代從酵米面中毒樣品中分離出一種稱為“酵米面黃桿菌”(Flavobacterium farinofermen-tans no sp)的食物中毒菌，其產生的外毒素-酵米面黃桿菌毒素A(簡稱黃桿菌毒素A,flavotoxin A)現證明即為米酵菌。

毒性

BA作為酵米面中毒和銀耳中毒的病原菌產生的毒素之一,具有很強的生物活性,是椰毒假單胞菌引起食物中毒和死亡的主要毒性代謝產物。臨床癥狀表現為惡心嘔吐、腹痛腹脹等,重者出現黃疸、腹水、皮下出血、驚厥、抽搐、血尿、血便等肝腦腎實質性器官損害癥狀。動物實驗亦表明,BA主要作用于肝、腦和腎等實質性臟器且以細胞內的線粒體*為敏感。國外有研究表明BA作用于胰腺β細胞抑制葡萄糖引起的電活性而造成高血糖,此后又可轉為低血糖,嚴重者出現低血糖昏迷。BA除對線粒體有破壞作用外,還可使部分巰基酶失活,因此解毒時可使用L-半胱氨酸等巰基化合物恢復由BA所抑制的巰基酶活性，減輕或解除BA的毒害。此外BA具有抑菌作用,對霉菌、酵母及某些細菌均有強烈的抑制和殺滅作用,12.5μg量的BA即可在平板上形成明顯的抑菌圈。

檢測方法

1. 國標法

GB 5009.189《食品安全國家標準 食品中米酵菌酸的測定》

(1)原理

試樣經提取、凈化、濃縮及過濾后,經高效液相色譜儀分析,外標法定量。

(2)材料

固相萃取柱:陰離子交換柱(60mg/3mL)或等效品,臨用前依次加5.0mL甲醇和5.0mL水活化,保持柱體濕潤。

米酵菌酸:純度≥95%,或經國家認證并授予標準物質證書的標準物質。

(3)標準溶液配制

米酵菌酸標準儲備液(0.1mg/mL):準確稱取米酵菌酸標準品1mg(精確至0.01mg),用甲醇溶解,轉移至10mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度。置于2°C~8°C冰箱中避光保存,有效期為6個月。

米酵菌酸標準系列工作液:分別吸取米酵菌酸標準儲備液用甲醇稀釋定容,配制成米酵菌酸濃度分別為0.3μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL的標準工作溶液。臨用時配制。

(4)分析步驟

A.固相萃取法：

提取：干試樣經粉碎過φ0.425mm篩后,稱取20g(精確至0.01g)置于錐形瓶中,加入100mL甲醇-氨水溶液;鮮(濕)試樣經剪碎、勻漿后稱取10g(精確至0.01g),加入80mL甲醇-氨水溶液。混勻,室溫下避光浸泡1h,置于超聲波振蕩器中超聲提取約30min,過濾。干試樣取濾液50mL,鮮(濕)試樣取濾液40mL。置80°C水浴中濃縮至約3mL,待凈化。

凈化：將濃縮后的試樣全部轉移到已活化的固相萃取柱中,依次用5mL水和5mL甲醇淋洗,棄去流出液,抽干萃取柱,再用6mL甲酸-甲醇溶液(2%)洗脫,收集洗脫液,于40°C±0.5°C水浴中氮吹至干,然后加入0.5mL甲醇,渦旋溶解,混勻,經微孔有機濾膜過濾后進行HPLC分析。

B.液-液萃取法

提取：干試樣經粉碎過φ0.425mm篩后,稱取20g(精確至0.01g),置于具塞錐形瓶中,加入20mL甲醇,室溫下避光浸泡1h,再加入80mL三氯甲烷和0.2mL磷酸溶液(45.4%);鮮(濕)試樣經剪碎、勻漿后稱取10g(精確至0.01g),加入16mL甲醇,于室溫下避光浸泡1h,再加入64mL三氯甲烷和0.16mL磷酸溶液(45.4%)。振蕩30min,過濾,干試樣取濾液50mL,鮮(濕)試樣取濾液40mL。

萃取：將上述濾液分別移入150mL分液漏斗中,加入與濾液等體積的碳酸氫鈉溶液(40g/L),振搖2min,靜置待分層后,取出下層于另一分液漏斗中;再用碳酸氫鈉溶液(40g/L)10mL重復提取兩次,輕搖;將三次提取的碳酸氫鈉溶液合并,加入25mL三氯甲烷,振搖2min,靜置分層后棄去三氯甲烷,于分液漏斗中慢慢加入鹽酸溶液(6mol/L)調該溶液pH至2~3,加入石油醚50mL(鮮、濕試樣為40mL),振搖3min,靜置分層,取出石油醚層于旋蒸瓶中,再分別用石油醚30mL和20mL各提取一次(鮮、濕試樣兩次均為20mL),將石油醚層并入同一瓶中,于40℃±0.5℃水浴中旋蒸濃縮至干,用少量甲醇分次將旋蒸瓶中提取物溶解并轉移至5.0mL玻璃離心管或濃縮瓶中,于40℃±0.5℃下氮吹濃縮至干,然后加入0.5mL甲醇,渦旋溶解,混勻,經微孔有機濾膜過濾后進行HPLC分析。

(5)色譜參考條件

色譜參考條件列出如下:

a) 色譜柱:C18色譜柱(柱長250mm,內徑4.6mm,粒度5μm)或同等性能的色譜柱;

b) 流動相:甲醇+水=75+25,水用冰乙酸調pH 至2.5;

c) 流速:1.0mL/min;

d) 柱溫:30℃;

e) 檢測波長:267nm;

f) 進樣量:20μL。

(6)標準曲線的制作

分別將 20μL米酵菌酸標準系列工作液注入液相色譜儀中,測定相應的峰面積,以標準工作液的濃度為橫坐標,以峰面積為縱坐標,繪制標準曲線。試樣溶液的測定將試樣溶液注入液相色譜儀中,以保留時間定性,同時記錄峰面積,根據標準曲線得到待測液中米酵菌酸的濃度。

(7)分析結果的表述試樣中米酵菌酸含量按式(1)計算:

X=(ρ×V×2)/m..............................(1)

式中:

X ———試樣中米酵菌酸的含量,單位為微克每克(μg/g);

ρ ———由標準曲線得到的試樣溶液中米醇菌酸的濃度,單位為微克每毫升(μg/mL);

V ———試樣溶液的濃縮定容體積,單位為毫升(mL);

2 ———稀釋倍數;

m ——— 試 樣 質 量 ,單 位 為 克 (g)。計算結果保留兩位有效數字。

(8)精密度

在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的**差值不得超過算術平均值的10%。

(9)其他

方法檢出限為0.005μg/g,定量限為0.015μg/g。

2. 超高效液相色譜串聯質譜法

利用超高效液相色譜串聯質譜法測定銀耳中的米酵菌酸。樣品采用甲醇提取，混合強陰離子交換固相萃取柱(PAX)凈化，UPLC BEH C(2.1×100 mm，1.7 μm)色譜柱分析，以 10 mmol/L 乙酸銨-乙腈為流動相，梯18度洗脫，串聯四級桿質譜多反應監測負離子模式檢測，基質匹配外標法定量。結果表明，米酵菌酸在 1.6 μg/L~80 μg/L 線性范圍內，相關系數(r)0.999 9，檢出限 0.5 μg/kg，加標回收率 82 %~102 %，相對標準偏差 RSD≤8.5 %。該方法快捷準確、靈敏度高，可用于銀耳中米酵菌酸的確證方法。

3. 其他測定方法

液相色譜-串聯質譜法、高效液相色譜-二*管陣列檢測器結合固相萃取法等新型方法。