作者:Lance 時間:2022-11-09 來源:互聯(lián)網(wǎng)
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一、激光共聚焦顯微鏡的基本組成
激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope,LSCM)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一項具有劃時代意義的高科技新產(chǎn)品,是當(dāng)今世界*先進的細(xì)胞生物學(xué)分析儀器。
激光共聚焦顯微鏡利用激光作為光源,在傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡基礎(chǔ)上采用共軛聚焦的原理和裝置,以及通過針孔的選擇和PMT的收集,并帶有一套對其所觀察到的對象進行數(shù)字圖像分析處理的系統(tǒng)軟件。與傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡相比,它具有更高的分辨率,實現(xiàn)多重?zé)晒獾耐瑫r觀察并可形成清晰的三維圖像等優(yōu)點。
所以它問世以來在生物學(xué)的研究領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用。
激光共聚焦顯微鏡主要有四部分組成:1、顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)。2、掃描裝置。3、激光光源。4、檢測系統(tǒng)。整套儀器由計算機控制,各部件之間的操作切換都可在計算機操作平臺界面中方便靈活地進行。
1、顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)
顯微鏡是LSCM的主要組件,它關(guān)系到系統(tǒng)的成像質(zhì)量。顯微鏡光路以無限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)可方便地在其中插人光學(xué)選件而不影響成像質(zhì)量和測量精度。物鏡應(yīng)選取大數(shù)值孔徑平場復(fù)消色差物鏡,有利于熒光的采集和成像的清晰。物鏡組的轉(zhuǎn)換,濾色片組的選取,載物臺的移動調(diào)節(jié),焦平面的記憶鎖定都應(yīng)由計算機自動控制。
2、掃描裝置
LSCM使用的掃描裝置在生物領(lǐng)域一般為鏡掃描。由于轉(zhuǎn)鏡只需偏轉(zhuǎn)很小角度就能涉及很大的掃描范圍,圖像采集速度大大提高,512×512畫面每秒可達(dá)4幀以上,有利于那些壽命短的離子作熒光測定。掃描系統(tǒng)的工作程序由計算機自動控制。
3、激光光源
LSCM使用的激光光源有單激光和多激光系統(tǒng)。多激光器系統(tǒng)在可見光范圍使用多譜線氬離子激光器,發(fā)射波長為457nm、488nm和514nm的藍(lán)綠光,氦氖綠激光器提供發(fā)射波長為543nm的綠光,氦氖紅激光器發(fā)射波長為633nm的紅光,新的405nm半導(dǎo)體激光器的出現(xiàn)可以提供近紫外譜線,但是小巧便宜而且維護簡單。
4、檢測系統(tǒng)
LSCM為多通道熒光采集系統(tǒng),一般有三個熒光通道和一個透射光通道,能升級到四個熒光通道,可對物體進行多譜線激光激發(fā),樣品發(fā)射熒光的探測器為感光靈敏度高的光電倍增管PMT,配有高速12位A/D轉(zhuǎn)換器,可以做光子計數(shù)。
PMT前設(shè)置針孔,由計算機軟件調(diào)節(jié)針孔大小,光路中設(shè)有能自動切換的濾色片組,滿足不同測量的需要,也有通過光柵或棱鏡分光后進行光譜掃描功能的設(shè)置。
二、激光共聚焦顯微鏡的特點以及在生物領(lǐng)域的應(yīng)用
傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡相比,激光共聚焦顯微鏡具有更高的分辨率,實現(xiàn)多重?zé)晒獾耐瑫r觀察并可形成清晰的三維圖像等優(yōu)點,在對生物樣品的觀察中,激光共聚焦顯微鏡有如下優(yōu)越性:
1、對活細(xì)胞和組織或細(xì)胞切片進行連續(xù)掃描,可獲得精細(xì)的細(xì)胞骨架、染色體、細(xì)胞器和細(xì)胞膜系統(tǒng)的三維圖像。
2、可以得到比普通熒光顯微鏡更高對比度、高解析度圖像、同時具有高靈敏度、杰出樣品保護。
3、多維圖像的獲得,如7維圖像(XYZaλIt):xyt 、xzt 和xt掃描,時間序列掃描旋轉(zhuǎn)掃描、區(qū)域掃描、光譜掃描、同時方便進行圖像處理。
4、細(xì)胞內(nèi)離子熒光標(biāo)記,單標(biāo)記或多標(biāo)記,檢測細(xì)胞內(nèi)如PH和鈉、鈣、鎂等離子濃度的比率測定及動態(tài)變化。
5、熒光標(biāo)記探頭標(biāo)記的活細(xì)胞或切片標(biāo)本的活細(xì)胞生物物質(zhì),膜標(biāo)記、免疫物質(zhì)、免疫反應(yīng)、受體或配體,核酸等觀察;可以在同一張樣品上進行同時多重物質(zhì)標(biāo)記,同時觀察;
6、對細(xì)胞檢測無損傷、精確、準(zhǔn)確、可靠和優(yōu)良重復(fù)性;數(shù)據(jù)圖像可及時輸出或長期儲存。
三、檢測儀器使用
服務(wù)內(nèi)容:
在熒光顯微鏡成象的基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置,使用紫外光或可見光激發(fā)熒光探針。
利用計算機進行圖象處理,從而得到細(xì)胞或組織內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖象。
可觀察固定的細(xì)胞、組織切片,還可對活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、分子、離子進行實時動態(tài)地觀察和檢測。
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