目的

檢測生產車間空氣、操作人員手部、與食品有直接接觸面的機械設備的微生物指標，生產區域環境當中病原微生物的監控，達到規定標準，以控制食品成品的質量。

一、參考標準

中華人民共和國國家標準《一次性使用衛生用品衛生標準》GB 15979-2002、《HACCP原理與實施》、中華人民共和國國家標準《公共場所空氣微生物檢驗方法細菌總數測定》GB/T 18204.1-2013、出入境檢驗檢疫局2004年《出入食品微生物檢驗培訓教材》中《出入食品生產廠衛生細菌檢驗方法》、日本東京冷凍食品檢驗方法。

二、采樣與檢測方法

A.空氣的采樣與測試方法

1.樣品采集：

取樣頻率：

a.車間轉換不同衛生要求的產品時，在加工前進行采樣，以便了解車間衛生清掃消毒情況。

b.全廠統一放長假后，車間生產前，進行采樣。

c.產品檢驗結果超內控標準時，應及時對車間進行采樣，如有檢驗不合格點，整改后再進行采樣檢驗。

d.實驗性新產品，按客戶規定頻率采樣檢驗。

e.正常生產狀態的采樣，每周一次。

2.采樣方法

在動態下進行，室內面積不超過30m2，在對角線上設里、中、外三點，里、外點位置距墻1m;室內面積超過30m2，設東、西、南、北、中五點，周圍4點距墻1m。采樣時，將含平板計數瓊脂培養基的平板(直徑9cm)置采樣點(約桌面高度)，并避開空調、門窗等空氣流通處，打開平皿蓋，使平板在空氣中暴露5min。采樣后必須盡快對樣品進行相應指標的檢測，送檢時間不得超過4h，若樣品保存于0～4℃條件時，送檢時間不得超過24h。

3.菌落培養：

a.在采樣前將準備好的平板計數瓊脂培養基平板置36℃±1℃ 培養24h，取出檢查有無污染，將污染培養基剔除。

b.將已采集樣品的培養基在4h內送實驗室，菌落總數于36℃±1℃培養48h觀察結果，計數平板上細菌菌落數。

4.菌落計算：

a.記錄平均菌落數，用“CFU/皿”來報告結果。用肉眼直接計數，標記或在菌落計數器上點計，然后用5～10倍放大鏡檢查，不可遺漏。

b.若培養皿上有2個或2個以上的菌落重疊，可分辨時仍以2個或2個以上菌落計數。

B.工作臺(機械器具)表面與工人手表面采樣與測試方法：

1.樣品采集：

①取樣頻率：

a.車間轉換不同衛生要求的產品時，在加工前進行擦拭檢驗，以便了解車間衛生清掃消毒情況。

b.全廠統一放長假后，車間生產前，進行全面擦拭檢驗。

c.產品檢驗結果超內控標準時，應及時對車間可疑處進行擦拭，如有檢驗不合格點，整改后再進行擦拭檢驗。

d.實驗新產品，按客戶規定擦拭頻率擦拭檢驗。

e.對工作表面消毒產生懷疑時，進行擦拭檢驗。

f.正常生產狀態的擦拭，每周一次。

②采樣方法：

a.工作臺(機械器具)：用浸有滅菌生理鹽水的棉簽在被檢物體表面(取與食品直接接觸或有一定影響的表面)取25cm2的面積，在其內涂抹10次，然后剪去手接觸部分棉棒，將棉簽放入含10mL滅菌生理鹽水的采樣管內送檢。

b.工人手：被檢人五指并攏，用浸濕生理鹽水的棉簽在右手指曲面，從指尖到指端來回涂擦10次，然后剪去手接觸部分棉棒，將棉簽放入含10mL滅菌生理鹽水的采樣管內送檢。

③采樣注意事項：

擦拭時棉簽要隨時轉動，保證擦拭的準確性。對每個擦拭點應詳細記錄所在分場的具體位置、擦拭時間及所擦拭環節的消毒時間。

2.細菌·大腸菌群的檢測培養:

樣液稀釋：將放有棉棒的試管充分振搖。此液為1：10稀釋液。如污染嚴重，可十倍遞增稀釋，吸取1ml 1：10樣液加9ml無菌生理鹽水中，混勻，此液為1：100稀釋液。

(1)菌落總數：

a.以無菌操作，選擇1～2個稀釋度各取1ml樣液分別注入到無菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿(平行樣)，將已融化冷至45℃左右的平板計數瓊脂培養基傾入平皿，每皿約15~20ml，充分混合。

b.待瓊脂凝固后，將平皿翻轉，置36℃±1℃ 培養48 h后計數。

c.結果報告：報告每25cm2食品接觸面中或每只手的菌落數 。

(2)大腸菌群：

①平板法:

a.以無菌操作，選擇1～2個稀釋度各取1ml樣液分別注入到無菌平皿內，每個稀釋度做兩個平皿(平行樣)，將VRBA培養基傾入平皿，每皿約15~20ml，充分混合。待瓊脂凝固后,再覆蓋一層培養基，約3-5 ml。

b.待瓊脂凝固后，將平皿翻轉，置36℃±1℃ 培養24h后計數。

c.證實實驗：從VRBA平板上挑取典型和可疑菌落接種BGLB進行證實實驗。

d. 結果計算：經*后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以平板上出現的典型和可疑菌落個數乘以稀釋倍數得出。

e.結果報告：報告每25cm2食品接觸面中或每只手的菌落數。

②MPN法:

a. 以無菌操作，選擇3個稀釋度各取1ml樣液分別接種到LST肉湯培養基中，每個稀釋度接種三管。

b.置LST肉湯管于36℃±1℃培養48±2h。記錄所有LST肉湯管的產氣管數。

c.選擇產氣渾濁的發酵管接種BGLB進行復發酵實驗。

d.結果報告：按BGLB肉湯管產氣管數，查MPN表報告每25cm2食品接觸面中或每只手的大腸菌群值。

(3)金黃色葡萄球菌檢測

①定性檢測

a.取1ml 稀釋液注入滅菌的平皿內，傾注15-20ml的B-P培養基，(或是吸取0.1稀釋液，用L棒涂布于表面干燥的B-P瓊脂平板)，放進36±1℃的恒溫箱內培養48±2小時。

b.從每個平板上至少挑取1個可疑金黃色葡萄球菌的菌落作血漿凝固酶實驗。

c.結果報告：B-P瓊脂平板的可疑菌落作血漿凝固酶實驗為陽性，即報告手(工器具)上有金黃色葡萄球菌存在。

②定量檢測

a.以無菌操作，選擇3個稀釋度各取1ml樣液分別接種到含7.5﹪氯化鈉胰蛋白胨大豆肉湯培養基中，每個稀釋度接種三管。

b.置肉湯管于36±1℃的恒溫箱內培養48小時。劃線接種于表面干燥的B-P瓊脂平板，置36℃±1℃ 培養45～48小時。

c.從B-P瓊脂平板上，挑取典型或可疑金黃色葡萄球菌菌落接種肉湯培養基，36℃±1℃培養20～24小時。

d.取肉湯培養物做血漿凝固酶試驗，記錄試驗結果。

e.報告結果：根據凝固酶試驗結果，查MPN表報告每25 cm2食品接觸面中或每只手的金黃色葡萄球菌值。

C.工廠環境中病原體的檢測計劃與方法

檢測計劃：為了保證食品安全，工廠應該對生產環境中的病原微生物進行檢測和評估，檢測項目包括李斯特菌，沙門氏菌等病原體微生物，化驗室應該按照一定的計劃對生產場所環境中的病原體進行檢測，其中包括地面、下水道、 排水溝、墻壁、天花板、設備框架、運輸的支架，冷藏裝置、速凍機、傳送帶、設備的螺絲、維修工具等部位。當某個點檢測到病員微生物時，應該對環境中的相似點加大檢測頻率;在把所有的預定點檢測完后，應該對環境中的病原微生物的存在狀況進行全面評估，在下一次環境檢測循環過程中加強檢測容易出現病原體的環境點，達到持續改進的目的。

檢測頻率: 每月兩次,每次每個區域至少選取5個檢測點,分別進行檢測。

1.環境李斯特菌的檢測方法(3MTM PetrifilmTM 環境李斯特菌的測試片)

(1)用涂抹棒，海綿或者其他采樣設備收集環境樣本。

(2) 將收集的樣本添加10毫升滅菌的緩沖蛋白胨水，將樣本與緩沖蛋白胨混合1分鐘，將樣品置于室溫(20-30℃)1小時，*久不超過1.5小時，以修復損傷的李斯特菌。

(3) 將測試片放在平坦處，掀起上層膜。

(4) 用移液器垂直滴加3毫升樣品到下層膜中央，將上層膜緩慢蓋下，以免產生氣泡。

(5) 輕輕將塑料壓板放在位于接種區上層膜上，不要壓，扭轉或者滑動壓板。提起壓板等至少十分鐘，以使膠體凝固。

(6) 將測試片透明面朝上，可疊放至十片，在37℃±1℃培養26-30小時，可以用標準菌落記數器或者其他光學放大器判讀，不要記數圓形輪廓上的菌落，因為他們不受選擇性培養基的影響。

(7) 對于定性檢測，根據紫紅色菌落是否存在，結果記為檢出或者未檢出。

2.環境中沙門氏菌的檢測方法

(1)采樣地點: 選取采樣點時因盡量選取微生物容易滋生的地方。

(2)操作步驟

a.采樣應在生產開始后進行，用已浸潤過的棉拭在選定的被測表面旋轉涂抹約100cm2的面積，然后將棉拭放回涂抹試管并蓋緊。

b.將樣品帶回實驗室，每5個點混合成一個樣品, 登記編號,按照標準及時檢測，若有陽性結果出現，應逐步對所混合的每個點分別檢測。