轉基因大豆是全世界種植面積*大的轉基因作物，由于導入了抗草甘膦基因EPSPS 基因(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)，可以編碼磷酸烯醇式丙酮酰莽草酸合成酶，能夠耐受除草劑草甘膦的傷害，方便大豆農業生產和管理。但是，隨著轉基因作物在世界范圍的廣泛種植，其食用安全和環境安全問題也引起了廣大消費者和各國政府的重視。轉基因作物在實驗室內產生，是大跨度、跳躍式的轉移基因，不同于漫長的自然選擇和相近物種的雜交，其本身的安全性未知，并可能對已有生物的多樣性產生影響，全球公眾對于轉基因植物及其產品安全性的爭論日趨激烈。因此，很多國家和地區紛紛制定轉基因生物安全管理法規，實施標簽制度，并積*開展轉基因作物檢測技術研究。
      轉基因檢測方法主要有核酸檢測和蛋白質檢測兩種。其中核酸檢測方法具有檢測靈敏度高、適用范圍廣、操作簡便等優點，且核酸在生物細胞中含量相對穩定，在產品加工中也不易破壞，因此核酸檢測成為轉基因產品的主要檢測方法。目前國內外轉基因產品核酸定量檢測相關標準物質很少，國內可檢索的有證標準物質只有一種轉基因大豆粉末標準物質。針對這種現狀，我們研制了一種適用于轉基因大豆GTS40-3-2定量檢測的質粒DNA標準物質，以質粒DNA濃度作為**特性量值，遵照ISO導則35的要求，我們對標準物質開展了嚴格的考查和數據統計。該質粒DNA分子序列經過多家單位驗證，我們對其中外源基因和內標準基因的比值進行了分析。該標準物質可以用于轉基因大豆GTS40-3-2定量檢測進行質量控制和方法驗證，確保檢測結果在國內外測量的可靠性、可比性和溯源性。該標準物質研制的完成，對于增強不同實驗室測量結果互認、提升我國轉基因檢測水平具有重要的現實意義。
      二、實驗部分
      1.儀器與試劑
      轉基因大豆粉GTS40-3-2標準物質GBW (E)100043，重鉻酸鉀溶液標準物質GBW(E)081609(購自中國計量科學研究院)；限制性內切酶、高保真Taq酶、dNTP、T4連接酶、大腸桿菌DH5α感受態細胞、質粒pUC19等(寶生物工程有限公司)；引物合成(上海生工生物工程有限公司)；其他生化試劑均為分析純。快速梯度PCR儀(ABI)； 實時熒光定量PCR儀(Life technologies)； 微量核酸蛋白定量儀(nanodrop2000)；高分辨電感耦合等離子體質譜(Thermo Element 2)。
      2.序列設計
      根據轉基因大豆GTS40-3-2外源插入載體在轉基因作物中的具體插入方式和拷貝數，以及外源插入載體中主要元件的序列信息，設計3對PCR引物(見表1)，分別用于擴增轉基因大豆GTS40-3-2的結構特異性基因、品系特異性基因、大豆內標準基因Lectin特異性序列。

      3.質粒DNA分子的構建
      根據表1的引物，以轉基因大豆GTS40-3-2基因組DNA為模板，對其結構特異性序列、品系特異性序列及大豆內標準基因序列進行PCR擴增，對產物進行回收純化。將3段基因序列分別克隆至載體pUC19上，大量培養重組大腸桿菌，經提取和純化獲得質粒DNA分子pXL02水溶液樣品。瓊脂糖凝膠電泳及微量核酸蛋白定量儀檢測其純度。質粒DNA標準物質溶液置于-20℃保存。
      質粒DNA標準物質pXL02的構建流程圖如圖1所示。

      4.高分辨電感耦合等離子體質譜(HR-ICP-MS)方法檢測質粒DNA濃度的方法
      質粒標準物質樣品中磷元素的含量和質粒分子的濃度有固定線性關系，在DNA中，每個堿基對應一個磷原子，分子中磷元素含量(質量分數)可由下式計算:含磷量(P%)=堿基數×磷的原子量÷DNA分子量。由此計算得出pXL02的含磷量(P%)為10.19%。HR-ICP-MS測量條件: 冷卻氣流量16.86L/min，輔助氣流量0.99L/min，霧化氣流量1.123L/min，功率1350W。
      5.均勻性檢驗
      按照JJF1006-1994《一級標準物質技術規范》均勻性抽取樣品要求，采用了UV法對質粒DNA標準物質的均勻性進行了考查。從標準物質樣品中隨機抽取15瓶，每個樣品重復測定3次。
      6.穩定性考查
      分別在制備完成后1、2、3、6、8、10、12個月，對質粒DNA標準物質隨機檢測，檢測方法采用UV法，每次抽取3瓶，每個樣品重復測定3次。
      7.標準物質定值
      以質粒分子的濃度作為特性量值，采用UV法和HR-ICP-MS法對質粒進行定值，兩種檢測方法均經過嚴格的考查和驗證，具體結果見三、2部分。由10家實驗室對質粒DNA標準物質進行聯合定值，每個實驗室分別隨機分發1瓶質粒DNA標準物質，平行測定8次。
      三、結果與討論
      1.質粒DNA標準物質的構建
     (1)將PCR擴增得到的709bp的結構特異性序列、337bp 的品系特異性序列和570bp的大豆內標準Lectin基因序列依次克隆到pUC19載體上，獲得質粒DNA標準物質pXL02，總序列為4266bp。提取之后經瓊脂糖凝膠電泳(見圖2)及微量核酸蛋白定量儀檢測，純度符合要求。
     質粒DNA標準物質電泳分析結果:泳道1為NheⅠ酶切產物，泳道2為SalI酶切產物，條帶3為EcoRⅠ酶切產物電泳結果，泳道4為marker。(2)為了驗證質粒分子序列正確性，并檢驗外源序列與內標準基因的比例，我們對質粒分子進行了多家單位多次重復序列驗證，實驗結果證明，質粒DNA標準物質插入序列與預期設計完全符合，其轉基因大豆GTS40-3-2的外源結構特異性序列、品系特異性序列、大豆內標準基因Lectin序列，均為單拷貝連入，即外源序列與內標準基因比例為1∶1。表2為具體驗證實驗結果。

     (3)大豆品系特異性基因和內標準基因比例的參考值確定
      采用PCR方法測得Ct值之比作為依據，分析了該質粒DNA分子的品系特異性基因片段GST與內標準基因片段Lectin的比例，結果Ct(GST)/Ct(Lectin)=1.0，標準偏差為0.032。結果數據如表3所示。

      2.定值方法考查結果
     (1)紫外分光光度法(UV)檢測質粒DNA的方法考查結果
      以重鉻酸鉀溶液標準物質考查UV法重復性和基線平直度，結果符合標準要求；以小牛胸腺DNA成分標準物質考查紫外分光光度計檢測DNA的準確性，結果符合標準物質標稱值和不確定度范圍。
     (2)HR-ICP-MS方法檢測質粒DNA的方法考查結果
      利用磷標準溶液建立標準曲線，檢測線性達到0.9997；對定量限進行考查，得出HR-ICP-MS的檢出限為0.06μg/L、測定下限為0.21μg/L，這些實驗數據表明該方法檢測質粒DNA標準物質的精密度良好。
      3.均勻性檢驗結果
      采用UV法，以質粒濃度為主要量值，以1μL為*小取樣量，采用方差分析法對該質粒DNA標準物質進行均勻性檢驗，在95%置信水平下，該套標準物質符合JJF1006-1994《一級標準物質技術規范》均勻性檢驗合格要求。具體統計數據如表4所示。

     4.穩定性考查結果
     采用UV法，以質粒濃度為主要量值，對質粒DNA標準物質的穩定性進行考查，考查結果見圖3。采用線性模型對穩定性考查數據進行統計。結果顯示，穩定性斜率β1的**值<t_0.95，10×s(β1)，斜率不顯著，表明該質粒DNA標準物質在規定時間內無明顯變化趨勢，可以判定質粒DNA標準物質在-20℃條件下可以穩定保存12個月。

      5.質粒DNA標準物質定值和不確定度評估
     (1)定值結果
     質粒DNA標準物質采用10家實驗室協同定值，經過數據檢驗和統計得到定值結果為137.0ng/μL(3.18×10¹⁰copies/μL)，結果如表5所示。
     (2)不確定度評定

      經統計，質粒DNA標準物質的不確定度來源由3部分組成。**部分為標準物質的不均勻性引起的不確定度u_bb=0.29ng/μL；第二部分為標準物質在有效期內的變動性引起的不確定度u_s=1.26ng/μL； 第三部分為標準物質的定值過程帶來的不確定度u_char=5.3ng/μL，其中包括數據統計引入的不確定度和通過對定值過程中影響因素進行分析評定得到的不確定度。將合成標準不確定度乘以包含因子k=2(置信區間P=0.95)，得到擴展不確定度。質粒DNA標準物質定值結果及不確定度如表6所示。

      6.質粒DNA標準物質與基體標準物質等效適用性驗證
      采用質粒DNA標準物質建立定量PCR標準曲線，對轉基因大豆GTS40-3-2標準物質(ERM-BF410gk，轉基因含量為10%)進行分析，定量分析結果顯示該樣品的轉基因含量為11.54%，與真實值的偏差為15.4%，檢測結果的偏差在ISO轉基因食品檢測標準允許的0～0.25范圍內。
      四、結束語
      本研究研制的轉基因大豆GTS40-3-2定量檢測質粒DNA標準物質，采用UV法和HR-ICP-MS法多家實驗室聯合定值，結果量值可靠，準確性、均勻性和穩定性良好，滿足《一級標準物質技術規范》要求。該標準物質的研制為轉基因大豆的定量檢測提供了量值溯源的依據，為轉基因大豆檢測實驗室質量控制提供有力保障。相信通過相應標準物質在我國轉基因作物檢驗實驗室的推廣應用，能夠進一步提高轉基因作物檢驗實驗室相關項目的檢測水平，保障各實驗室測量結果的可比性、準確性，為檢驗結果的互認和共享打下了良好的基礎。
轉載自中國計量網