大豆分離蛋白又稱為等電點蛋白粉，它是指除去大豆中油脂、可溶性及不可溶性碳水化合物后的大豆蛋白質(zhì)。大豆分離蛋白中蛋白質(zhì)含量高達90%以上，由于其蛋白純度高，是具有加工功能性的食品添加用的中間原料，近年來被廣泛應用于肉食品、乳制品、冷食冷飲、焙烤食品及保健食品等［1］。自從2007年美國寵物食品污染事件和2008年三鹿奶粉污染事件［2］之后，為了防止在食品或者食品原料（比如大豆分離蛋白）中人為加入三聚氰胺這類食品安全事件的發(fā)生，我國相關(guān)部門加大了對所有列入法檢目錄的植物源蛋白類產(chǎn)品的監(jiān)管力度，重點進行三聚氰胺項目檢測，凡發(fā)現(xiàn)三聚氰胺的，一不得出口，也不得在國內(nèi)銷售。雖然我國已經(jīng)頒布了數(shù)項三聚氰胺檢測標準［3–6］，卻沒有適用于大豆分離蛋白產(chǎn)品的檢測標準。適用范圍相對接近的GB／T22288–2008也僅限于小麥粉、玉米粉和大米粉中三聚氰胺的檢測，并且檢測器為氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，價格昂貴，檢測成本高。基于GB／T22388–2008和NY／T1372–2007，筆者采用高效液相色譜法測定大豆分離蛋白中三聚氰胺的含量，對檢測過程中存在的基質(zhì)效應進行了討論，為建立檢測標準提供參考。

1實驗部分

1．1主要儀器與試劑

液相色譜儀：Ultimate3000型，配UV檢測器，美國賽默飛公司；臺式低速離心機：TDZ5–WS型，湖南湘儀公司；超聲波清洗器：KQ500E型，江蘇昆山超聲儀器公司；渦旋震蕩器：VORTEX–GENIE2型，美國ScientificIndustries公司；氮吹儀：TTL–DCII型，北京同泰聯(lián)公司；聚合物陽離子交換固相萃取柱：60mg／3mL，安捷倫科技公司；三聚氰胺標準品：迪馬科技公司；三聚氰胺標準儲備溶液：1000mg／L，取適量三聚氰胺標準品，用色譜純級甲醇–水（體積比1∶1）的混合溶液配制而成；辛烷磺酸鈉、甲醇、乙腈：色譜純；檸檬酸、乙酸鉛、三氯乙酸、甲醇、鹽酸、氨水：分析純；離子對試劑緩沖液：準確稱取2.10g檸檬酸和2.16g辛烷磺酸鈉，加水定容至1L，搖勻。

1．2樣品前處理

(1)提取。稱取混合均勻的樣品2.00g置于100mL具塞離心管中，加入1%三氯乙酸溶液25mL，飽和乙酸鉛溶液2mL，渦旋1min混勻，超聲提取30min，以5000r／min離心10min，吸取上清液待過濾。(2)凈化。依次用3mL甲醇、3mL水活化聚合物陽離子交換固相萃取柱，取5mL濾液進行固相萃取，用3mL0.1moL／mL鹽酸溶液、3mL甲醇淋洗，然后用6mL5%氨化甲醇[氨水–甲醇（體積比5∶95）]溶液洗脫，收集洗脫液，在55℃條件下氮氣吹干。以流動相定容至1mL，經(jīng)0.22μm水相過濾器過濾后，進樣測定。

1．3色譜條件

色譜柱：C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動相：離子對試劑緩沖液–乙腈（體積比80∶20），流速為1mL／min；柱溫：40℃；波長：240nm；進樣量：20μL。

1．4基質(zhì)匹配標準溶液配制

移取適量三聚氰胺標準儲備溶液以甲醇–水（體積比1∶1）溶液逐級稀釋，得到濃度為0.4，0.8，4，8，40mg／L的系列標準工作溶液。取系列標準工作溶液各1mL，分別加入到經(jīng)過提取、凈化后的6mL空白樣品中，氮氣吹干，流動相定容至1mL，即為基質(zhì)匹配標準溶液。

2結(jié)果與討論

2．1樣品前處理條件的選擇

三聚氰胺溶于甲醇、乙酸，顯弱堿性，能夠與各種酸反應生成三聚氰胺鹽，實驗表明，采用甲醇作為提取溶劑時，脂肪同時被提取出來，經(jīng)紫外檢測時，出現(xiàn)大量雜質(zhì)峰，從而干擾、掩蓋目標峰；采用三氯乙酸溶液提取可獲得較好的效果，能夠去除大部分蛋白質(zhì)和脂肪，但仍有少量蛋白質(zhì)殘留在提取液中。因此向提取液中加入2mL飽和乙酸鉛溶液，即可將蛋白質(zhì)完全沉淀。樣品經(jīng)1%三氯乙酸和飽和乙酸鉛提取，再采用陽離子交換固相萃取小柱凈化，能夠有效沉淀蛋白、除去脂肪和雜質(zhì)。三聚氰胺標準溶液和大豆分離蛋白樣品加標后的液相色譜圖分別見圖1、圖2。

2．2基質(zhì)效應的影響

在測定添加回收率時，與標準溶液比較2，4，20mg／kg3個濃度水平的回收率僅為72.88%～82.50%，結(jié)果偏低，經(jīng)分析可能是基質(zhì)效應影響的結(jié)果。為驗證大豆分離蛋白中基質(zhì)效應對三聚氰胺的檢測是否產(chǎn)生影響，對基質(zhì)匹配標準溶液和標準溶液進行比較，結(jié)果見表1、表2。由表1、表2可知，各濃度基質(zhì)匹配標準溶液的峰面積較標準溶液的峰面積平均減小9.18%左右，大豆分離蛋白中的基質(zhì)效應較為明顯，所以大豆分離蛋白對于三聚氰胺表現(xiàn)為抑制作用，對于回收率的影響也相應表現(xiàn)為抑制效應，導致回收率結(jié)果偏低。因此以基質(zhì)匹配標準工作溶液計算回收率，各濃度提高12%。因此在檢測大豆分離蛋白中三聚氰胺含量時，必須考慮基質(zhì)效應的影響，用基質(zhì)匹配標準工作溶液進行定量分析。

2．3工作曲線方程及檢出限

實驗采用外標法定量，將濃度為1000mg／L的三聚氰胺標準儲備液用甲醇－水（體積比1∶1）溶液逐級稀釋得到濃度為0.4，0.8，4，8，40mg／L的系列標準工作溶液和基質(zhì)匹配標準工作溶液，進行色譜測定，以質(zhì)量濃度（mg／L）為橫坐標、以色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)見表3。

由表3可知，標準工作溶液和基質(zhì)匹配標準工作溶液的標準曲線線性均較好，相關(guān)系數(shù)相差很小，因此可以使用基質(zhì)匹配標準工作溶液代替標準工作溶液進行定量計算。按3倍信噪比計算檢出限，以10倍信噪比計算定量限。經(jīng)計算三聚氰胺在大豆分離蛋白中的定量限為2mg／kg，檢出限為0.6mg／kg。

2．4加標回收率和精密度試驗

以大豆分離蛋白空白樣品（經(jīng)過檢測，不含有三聚氰胺）作為測試樣品，在2，4，20mg／kg3個濃度水平上進行添加回收試驗，按1.2方法進行提取、凈化，在相同條件下測試6個平行樣，測定結(jié)果見表4。由表4可知，三聚氰胺的回收率為78.82%～92.95%，相對標準偏差小于2%。

3結(jié)語

在不具備氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測器和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測器的條件下，用液相色譜（紫外檢測器）法檢測大豆分離蛋白中三聚氰胺的含量，該方法經(jīng)濟，結(jié)果準確可靠，能夠滿足大部分大豆分離蛋白生產(chǎn)企業(yè)的自檢要求及檢測機構(gòu)的檢驗要求。