五靈脂（FaecesTrogopterori）是哺乳綱鼯鼠科動物復(fù)齒鼯鼠（TrogopterusxanthipesMilne-Edwards）的干燥糞便，分為靈脂米和靈脂塊兩種。靈脂米即復(fù)齒鼯鼠的干燥糞便，靈脂塊是其糞便與尿液的混合物夾以少量砂石干燥凝結(jié)而成［1］。五靈脂具有行血散瘀止痛的功效，用于治療產(chǎn)后子宮復(fù)舊不全、毒蛇咬傷、胃脘痛經(jīng)久不愈等［2］。原兒茶酸（3，4-二羥苯甲酸Protocatechunicacid）具有增加冠脈血流、緩解心絞痛的作用，是五靈脂的重要活性成分單體之一，是一種水溶性酚酸成分，具有顯著降低心肌耗氧量、提高心肌耐氧能力、減慢心率等藥理作用，并且對乙肝病毒的脫氧核糖核酸（DNA）復(fù)制具有較強的抑制作用［3］。目前五靈脂中原兒茶酸的測定方法主要是液相色譜法［4–5］和分光度法［6］；樣品前處理主要使用超聲提取和水浴加熱提取兩種方式，缺點是耗時長，試劑用量大、揮發(fā)多。筆者采用加速溶劑萃取法（ASE），具有萃取時間短、溶劑用量少和萃取效率高等突出優(yōu)點。該法的研究將為控制五靈脂藥材的質(zhì)量提供參考。

1實驗部分

1.1主要儀器與試劑

液相色譜儀：Waters2695型，配有紫外檢測器，美國沃特斯公司；渦旋儀：MS3型，德國IKA公司；超聲儀；SK8200LH型，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；高純水發(fā)生器：Milli-QⅡ型，美國密理博公司；離心機：T–124型，瑞士KONTRON公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE–52AA型，上海亞榮生化儀器廠；加速溶劑萃取儀（ASE）：ASE200型，美國戴安公司；原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)品：東京化學(xué)工業(yè)公司；甲醇、乙腈：色譜純，美國Fisher公司；再生纖維素濾膜：0.2μm，美國安捷倫公司；五靈脂樣品：市售和蒙古國進(jìn)口樣品；其它試劑均為優(yōu)級純；實驗用水為二次凈化水。

1.2溶液配制

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液

準(zhǔn)確稱取適量原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配成100mg／L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，儲存于–18℃冰箱，保存期18個月。根據(jù)實驗需要，用甲醇稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
1.2.2樣品提取液

750mL無水乙醇和250mL水混合。

1.3液相色譜條件

液相色譜柱：DiamosilC18（4.6mm×250mm，5.0μm，迪馬科技公司）；流動相：甲醇（A）和0.5%的乙酸水溶液（B）；梯度洗脫程序：0～10min時85%～60%的A，10～15min時60%～15%的A，15～22min時15%的A，22～25min時15%～85%的A，25～30min時85%的Ａ；流速：1.0mL／min；

柱溫：35℃；分析波長：260nm。
1.4樣品處理

稱取1.0g樣品，添加0.2g硅藻土，混勻后置于11mL加速溶劑萃取池中（下部預(yù)先添加少量海沙），上部添加海沙至平，擰緊萃取池冒，放入加速溶劑萃取池盤中。ASE條件：溶劑為乙醇–水（體積比75∶25），溫度為100℃，壓力為15MPa，預(yù)熱時間為5.0min，靜態(tài)萃取時間為10.0min，循環(huán)次數(shù)為3次。接收池溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至約5mL，用提取液定容至5.0mL，過0.2μm的再生纖維素膜，上液相色譜測定。

1.5色譜圖

在1.3的色譜條件下，原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖1。

2結(jié)果與討論

2.1色譜柱和流動相的選擇

原兒茶酸為白色至褐色結(jié)晶性粉末，在空氣中變色。其結(jié)構(gòu)為苯環(huán)上含有兩個羥基和一個羧基。原兒茶酸的屬于*性稍強物質(zhì)，在反相色譜柱上有保留。參考待測物的性質(zhì)和相關(guān)文獻(xiàn)［7］，選擇反相C18色譜柱分離待測物。通過比較甲醇和酸性（乙酸和磷酸）水溶液，乙腈和酸性（乙酸和磷酸）水溶液，依據(jù)基線噪音的高低和目標(biāo)物與雜質(zhì)的分離度進(jìn)行選擇。實驗結(jié)果表明，甲醇和0.5%乙酸的水溶液作為流動相，噪音較低，分離度較好。

2.2提取條件的選擇

原兒茶酸常用的提取液有乙醇水溶液和甲醇水溶液。由于甲醇毒性較大，因此選擇乙醇和水的溶液提取。加速溶劑萃取技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種在高溫（室溫～200℃）、高壓（0.1～20MPa）條件下快速提取固體或半固體樣品的樣品前處理方法，與常用的索氏提取、超聲提取、微波萃取技術(shù)等方法相比具有節(jié)省溶劑、快速、健康環(huán)保、自動化程度高等優(yōu)點。該技術(shù)廣泛應(yīng)用環(huán)境分析、農(nóng)產(chǎn)品安全、制藥、天然產(chǎn)物提取和能源等諸多領(lǐng)域，適合色譜分析樣品預(yù)處理。

筆者依據(jù)待測物質(zhì)和提取溶劑的性質(zhì)選擇性試驗了加速溶劑提取的溫度、壓力、提取時間和循環(huán)次數(shù)等條件，并參照色譜上的保留行為和其含量變化選擇條件，實驗*終確定的提取條件：溫度100℃，壓力15MPa，預(yù)熱5min，靜態(tài)提取10min，循環(huán)次數(shù)為3次。

2.3工作曲線方程、檢出限及定量限

用原兒茶酸的標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，原兒茶酸的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度分別為0.1，0.3，0.5，1.0，5.0，10.0mg／L。在1.3色譜條件下分別進(jìn)行測定，以色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以原兒茶酸的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=0.045X＋0.029，相關(guān)系數(shù)r=0.9998，線性范圍為0.1～10.0mg／L。以3倍信噪比計算得檢出限為0.5mg／kg，以10倍信噪比計算定量限為1.0mg／kg。

2.4回收率和精密度試驗

利用五靈脂樣品進(jìn)行3個添加水平的回收試驗，每個水平重復(fù)5次。原兒茶酸的添加量是1.0，2.0，5.0mg／kg3個水平，回收率和精密度的試驗結(jié)果見表1。由表1可知，該方法有較好的精密度和準(zhǔn)確度，可以滿足五靈脂中原兒茶酸含量檢測需要。

2.5樣品測定

將本方法用于實驗室中25份五靈脂樣品的分析，對樣品中的原兒茶酸含量進(jìn)行測定，*終定容體積依據(jù)其含量水平稀釋到線性范圍內(nèi)，根據(jù)化合物的色譜保留時間和光譜圖來鑒別樣品。所測定樣品中原兒茶酸的含量水平為0.01%～0.1%范圍內(nèi)。