蛋白質(zhì)具有許多優(yōu)良的特性，在國內(nèi)外不少檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中［1–2］被選定為評(píng)價(jià)超濾膜截留性能的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，因而被生產(chǎn)商廣泛用于超濾膜生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制。大部分高純度蛋白價(jià)格比較昂貴，實(shí)際檢測(cè)工作中多使用價(jià)格較為低廉的牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)超濾膜截留性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。而無論是市售蛋白還是實(shí)驗(yàn)室自行分離純化獲得的蛋白，其相對(duì)分子質(zhì)量及其分布均存在一定差異，這會(huì)在一定程度上影響超濾膜截留性能的檢測(cè)結(jié)果和評(píng)價(jià)結(jié)論。

測(cè)定聚合物的相對(duì)分子質(zhì)量、相對(duì)分子質(zhì)量分布通常采用高效凝膠排阻色譜法進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)樣品應(yīng)該選擇窄相對(duì)分子質(zhì)量分布的物質(zhì)，且當(dāng)2×103Da<Mp<106Da（Mp為峰值相對(duì)分子質(zhì)量）時(shí)，聚合物的相對(duì)分子質(zhì)量分布寬度指數(shù)D（/MMwn）＜1.10（Mw為重均相對(duì)分子質(zhì)量、Mn為數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量）才能用作標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)［3］。因此利用高效凝膠色譜儀對(duì)牛血清白蛋白樣品進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量、相對(duì)分子質(zhì)量分布進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于完善超濾膜截留性能的檢測(cè)方法具有非常重要的意義。

標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)［4–5］中多利用色譜柱在一定流動(dòng)相條件下對(duì)于低相對(duì)分子質(zhì)量的多肽和蛋白樣品進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量及其分布進(jìn)行研究，而對(duì)用于超濾膜性能評(píng)價(jià)的相對(duì)分子質(zhì)量為104～105Da的蛋白質(zhì)研究較少。使用不同的色譜柱、在不同的流動(dòng)相、離子強(qiáng)度、pH值等參數(shù)下，對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量及其分布的檢測(cè)結(jié)果也有一定差異。由于蛋白質(zhì)溶解于純水中時(shí)溶液的酸堿度接近于中性，而文獻(xiàn)中多采用有機(jī)相和較低pH值的流動(dòng)相對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)量［6–8］，這和評(píng)價(jià)超濾膜截留性能時(shí)所采用的接近于中性的溶液環(huán)境有很大差異，因此采用接近于中性的流動(dòng)相作為實(shí)驗(yàn)條件更加符合實(shí)際情況。

到目前為止，我國已經(jīng)定值的、適合用于評(píng)價(jià)超濾膜的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)只有牛血清白蛋白（Mp=66446Da）、馬心肌紅蛋白（Mp=16951Da）、細(xì)胞色素C（Mp=12355Da）。由于所購蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的定值方法與本方法不同，本實(shí)驗(yàn)以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書給出的參考值作為Mp使用。其它相對(duì)分子質(zhì)量為104～105Da的蛋白質(zhì)尚未得到準(zhǔn)確定值，本實(shí)驗(yàn)以供應(yīng)商提供的數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)值作為Mp，建立一種可以快速檢測(cè)10～67kDa的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量和相對(duì)分子質(zhì)量分布的檢測(cè)方法，并將該方法用于牛血清白蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量和相對(duì)分子質(zhì)量分布的測(cè)定。

1實(shí)驗(yàn)部分

1．1主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent1260Infinity型，美國安捷倫公司；移液器：100～1000μL，德國Eppendorf公司；電子天平：CP225D型，德國Sartorius公司；pH計(jì)：ORION3STAR型，美國Thermo公司；超純水機(jī)：UPH–I–40型，成都超純科技有限公司；樣品管：5mL；過濾頭：0.45μm孔徑醋酸纖維素膜；醫(yī)用注射器：2mL；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉：均為色譜純，美國Sigma公司；氯化鈉：色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；高效凝膠排阻色譜柱：TSKgelG3000SWXL型（300mm×7.8mm），日本東曹公司；混合色譜標(biāo)準(zhǔn)品：含甲狀球蛋白、γ球蛋白、雞卵清白蛋白、馬心肌紅蛋白、維生素B12，美國Biorad公司；牛血清白蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、細(xì)胞色素C相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：中國計(jì)量科學(xué)研究院；β乳球蛋白：美國Sigma公司。

1．2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液和樣品溶液的配制

將一瓶混合色譜標(biāo)準(zhǔn)品（以下簡稱Biorad混標(biāo)）溶解于10mL流動(dòng)相中，其中甲狀球蛋白、γ球蛋白、雞卵清白蛋白各含5mg，馬心肌紅蛋白含量約為2.5mg，維生素B12約為0.5mg。分別稱取牛血清白蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、細(xì)胞色素C相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和β乳球蛋白各約5mg，溶解于10mL流動(dòng)相［0.05mol／L磷酸鹽緩沖溶液（pH6.8）–0.3mol／L氯化鈉溶液］中，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（以下簡稱混標(biāo)C）。稱量約5mg待測(cè)蛋白樣品，溶解于10mL流動(dòng)相中。將Biorad混標(biāo)、混標(biāo)C及待測(cè)蛋白樣品分別用0.45μm的醋酸纖維素過濾膜過濾，上機(jī)測(cè)定。

1．3標(biāo)準(zhǔn)品的紫外吸收光譜

將相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品配制成適當(dāng)濃度的溶液，在凝膠色譜儀中可以直接測(cè)得各種分離組分的色譜數(shù)據(jù)，根據(jù)測(cè)定結(jié)果選擇220nm作為檢測(cè)波長。根據(jù)所有被分析的標(biāo)準(zhǔn)品和蛋白質(zhì)樣品的光譜數(shù)據(jù)，選擇300～330nm范圍的參比波長以獲得*佳響應(yīng)值。

1．4色譜條件

高效凝膠排阻色譜柱：TSKgelG3000SWXL型（300mm×7.8mm）；進(jìn)樣體積：20μL；流動(dòng)相：0.05mol／L磷酸鹽緩沖溶液（pH6.8）–0.3mol／L氯化鈉溶液，流速為1mL／min；檢測(cè)器：DAD；檢測(cè)波長：220nm；信號(hào)采集時(shí)間：15min。

1．5數(shù)據(jù)處理

采用Agilent1260化學(xué)工作站配置的GPCadd-on數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。在軟件中打開標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液的色譜圖，指定相應(yīng)的色譜峰并輸入相應(yīng)的相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量信息，采用線性擬合方法，軟件自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后打開樣品溶液的色譜圖，選定使用的標(biāo)準(zhǔn)曲線及需要計(jì)算的相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍，軟件自動(dòng)計(jì)算出樣品的相對(duì)分子質(zhì)量（峰值相對(duì)分子質(zhì)量Mp、數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量Mn、重均相對(duì)分子質(zhì)量Mw、Z均相對(duì)分子質(zhì)量MZ）及相應(yīng)的相對(duì)分子質(zhì)量分布。使用色譜圖積分面積百分比法可得樣品的主組分占可檢出組分的比例約為85%。根據(jù)軟件計(jì)算出的相對(duì)分子質(zhì)量及相對(duì)分子質(zhì)量分布情況，該牛血清白蛋白樣品中主組分在60～80kDa相對(duì)分子質(zhì)量范圍的Mp為7.3211×104Da，其相對(duì)分子質(zhì)量分布指數(shù)D在1.0092～1.0096之間，滿足D小于1.10的條件，見圖1。

2結(jié)果與討論

2．1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和流動(dòng)相的選擇

分別使用混合色譜標(biāo)準(zhǔn)品、牛血清白蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、馬心肌紅蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、細(xì)胞色素C相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、β乳球蛋白、鐵蛋白、過氧化物酶、雞卵清白蛋白、核糖核酸酶A，選取3種流動(dòng)相配比進(jìn)行試驗(yàn)：T1流動(dòng)相為0.1mol／L磷酸鹽緩沖溶液（pH6.7）–0.1mol／LNa2SO4溶液；T2流動(dòng)相為0.05mol／L磷酸鹽緩沖溶液（pH6.8）–0.3mol／LNaCl溶液；T3流動(dòng)相0.1mol／L磷酸鹽緩沖溶液（用NaOH溶液調(diào)至pH6.8）–0.2mol／LNaCl溶液。將上述標(biāo)準(zhǔn)品分成若干組，分別混合，并在相應(yīng)的流動(dòng)相中溶解后進(jìn)樣。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過氧化物酶與Biorad混標(biāo)中的雞卵清白蛋白、核糖核酸酶A與Biorad混標(biāo)中的細(xì)胞色素C在色譜中的保留體積非常接近而且相對(duì)分子量相對(duì)偏差不超過10%，所以予以剔除［9］。由于鐵蛋白的純度不佳、維生素B12為非采樣點(diǎn)，所以將二者剔除。所選蛋白標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在3種流動(dòng)相條件下線性擬合曲線的相關(guān)系數(shù)r2分別為0.9883，0.9953，0.9946。

選用Biorad混標(biāo)和混標(biāo)C，在T2流動(dòng)相條件下，分兩組進(jìn)樣，可達(dá)到基線分離且峰形較好，如圖2。相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值y與保留體積x（mL）的線性方程為y=–0.3302x+7.9618，線性相關(guān)系數(shù)r2為0.9953。

2．2檢測(cè)波長的選擇

使用DAD檢測(cè)器可直接獲得選用蛋白質(zhì)樣品在210～400nm范圍內(nèi)的光譜數(shù)據(jù)，如圖3。由圖3可以看出，所有選用的蛋白質(zhì)樣品都在280nm處有吸收峰，而在220nm處的吸光度要遠(yuǎn)高于280nm處。馬心肌紅蛋白和細(xì)胞色素C在340～400nm附近吸光度逐漸高于280nm處的吸光度。因此選擇220nm作為檢測(cè)波長、300～330nm作為參比波長可以避免負(fù)峰的出現(xiàn)和獲得較高的靈敏度。

2．3測(cè)量精密度和準(zhǔn)確度

采用T2流動(dòng)相和優(yōu)選的7種蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)牛血清白蛋白樣品主組分中相對(duì)分子質(zhì)量60～80kDa范圍的蛋白分布進(jìn)行測(cè)定。連續(xù)兩天，進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，每組均采用Biorad混標(biāo)和混標(biāo)C新制作一條校準(zhǔn)曲線。**天進(jìn)樣一組，進(jìn)樣1次，平行進(jìn)樣3針；第二天進(jìn)兩組，每組進(jìn)樣3次，每次平行進(jìn)樣3針。計(jì)算測(cè)定結(jié)果的平均值及組內(nèi)和組間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，數(shù)據(jù)見表1。由表1數(shù)據(jù)計(jì)算得該方法組內(nèi)總平均值為83.410%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.004%～0.014%；組間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.89%，選定顯著水平α=0.05，經(jīng)過F檢驗(yàn)可以判定3組數(shù)據(jù)的精密度沒有顯著差異，屬于等精密度測(cè)量。測(cè)量精密度可以滿足一般實(shí)驗(yàn)室對(duì)牛血清白蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)定的要求。

選定顯著水平α=0.05；將3組數(shù)據(jù)進(jìn)行互相比對(duì)，自由度f1–2，f1–3，f2–3分別為10，10，16；根據(jù)公式計(jì)算合并樣本方差Sp(1–2)，Sp(1–3)，Sp(2–3)分別為0.007，0.006，0.004；根據(jù)公式計(jì)算統(tǒng)計(jì)量結(jié)果，并查表，結(jié)果為t1–2=228.11＞t0.05，10=2.23，t1–2=622.48＞t0.05，10=2.23，t1–2=807.67＞t0.05，16=2.16。經(jīng)過t檢驗(yàn)可判定組間測(cè)量結(jié)果存在不可忽略的差異，這說明用凝膠排阻色譜法測(cè)定牛血清白蛋白相對(duì)分子質(zhì)量分布的方法，在不同組進(jìn)行測(cè)量時(shí)存在一定的系統(tǒng)誤差，測(cè)量結(jié)果具有參考價(jià)值。

由于目前測(cè)量相對(duì)分子質(zhì)量分布沒有參考標(biāo)準(zhǔn)，所以對(duì)于該方法的準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)可以考慮使用校準(zhǔn)曲線計(jì)算出某種蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量與其參考值進(jìn)行比對(duì)。采用牛血清白蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為樣品，連續(xù)6天，分6組進(jìn)樣。根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值y與保留體積x（mL）的線性方程為y=–0.3302x+7.9618，計(jì)算出該樣品的Mp，以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書給定的值66446Da作為Mp的參考值，計(jì)算其相對(duì)誤差，并得出均值的相對(duì)誤差為7.76%，見表2。結(jié)果表明，通過校準(zhǔn)曲線計(jì)算出的Mp值與參考值有一定程度的偏離，使用該方法對(duì)樣品分子量的測(cè)量具有參考價(jià)值。

2．4不同來源的同種蛋白保留時(shí)間差異性考察

分別將不同來源和相同來源的牛血清白蛋白質(zhì)分組進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算測(cè)量結(jié)果，并對(duì)測(cè)量結(jié)果進(jìn)行F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)［10–11］，檢驗(yàn)結(jié)果見表3和表4。選定顯著水平α=0.05進(jìn)行雙側(cè)F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)。F檢驗(yàn)結(jié)果表明，無論是否同種來源的蛋白其測(cè)量屬于等精度測(cè)量。t檢驗(yàn)結(jié)果表明，分別來自中國計(jì)量科學(xué)研究院（表3中簡稱計(jì)量院）和Sigma公司（表3中簡稱Sigma）的牛血清白蛋見白其淋洗體積差異顯著；對(duì)同種來源的牛血清白蛋白，組1和組2之間的淋洗體積差異不顯著，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同來源的同種蛋白，其保留體積（時(shí)間）也可能有略微差異，并且這種差異不可忽略。在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)盡可能采用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，否則會(huì)增大測(cè)量結(jié)果的不確定度。

3結(jié)語

高效凝膠排阻色譜法測(cè)定超濾膜截留性能評(píng)價(jià)用牛血清白蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量及其分布，分析速度快，可以提高檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)于截留標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量控制，對(duì)于完善超濾膜截留性能評(píng)價(jià)方法具有重要意義。

該方法測(cè)量牛血清白蛋白相對(duì)分子質(zhì)量有一定的誤差，因此僅具有參考價(jià)值。