高效液相色譜法，但方法均較繁瑣，費用高［4–5］，鮮牛奶中氨基酸的測定多采用分光光度法，此類方法只能檢測氨基酸的總量［6–7］。我國國家標準中規定［8–9］：食品中氨基酸的測定采用氨基酸與茚三酮衍生法的氨基酸分析儀檢測；乳與乳制品中非蛋白氮含量的測定采用酸堿滴定法。但經大量實驗說明前法存在分析誤差大（10%～20%）、分析柱再生復雜及耗時長等問題，后法僅能測定氨基酸的總含量。筆者利用高效毛細管電泳法，茚三酮作為衍生試劑測定了純奶中甘氨酸的含量，用氯化鎂作為奶樣蛋白沉淀劑，沉淀效果較好。筆者重點研究了茚三酮與甘氨酸衍生條件，在加熱時，樣品中加入沸石并使用了專用的自動控溫加熱裝置，這一步驟成為樣品顯色均勻且穩定的重要條件。

甘氨酸（glycine，又名氨基乙酸或乙氨酸）是氨基酸系列中結構*簡單、組成蛋白質的20多種氨基酸中的一種，為人體非必需的一種氨基酸。因為它具有特殊甜味，能緩和酸、堿味，掩蓋食品中添加糖精的苦味并增強甜味，故又被稱為膠糖。目前甘氨酸被廣泛地應用于醫藥、食品、農藥等領域［1–3］。人體若攝入過量的甘氨酸，不僅不能吸收利用，而且會打破人體對氨基酸的吸收平衡而影響其它氨基酸的吸收，導致營養失衡而影響健康。以甘氨酸為主要原料生產的含乳飲料，對青少年及兒童的正常生長發育很容易帶來不利影響。目前，氨基酸的檢測多采用衍生化氣相色譜及

1實驗部分

1．1主要儀器與試劑

高效毛細管電泳儀：TH–3000型，保定天惠分離科學研究所；未涂層毛細管：60cm×75μm，河北永年光導纖維廠；自動雙重純水蒸餾器：SZ–93型，上海亞榮生化儀器廠；酸度計：pH–3C型，上海偉業儀器廠；超聲波清洗器：SK5200H型，昆山市超聲儀器有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鎂、硼砂、氫氧化鈉、無水乙醇、丙酮、乙腈、乙二醇、和茚三酮：分析純；

標準品甘氨酸：生化試劑，上海藍秀科技發展有限公司；實驗用水均為二次蒸餾水。

1．2溶液配制

甘氨酸標準溶液：準確稱取0.1000g甘氨酸標準品，加水溶解于100mL容量瓶中，用水溶解并定容，配成1.0000g／L甘氨酸儲備液。分別準確移取0.00，0.10，0.50，2.50，5.00，7.50，10.00mL甘氨酸儲備液于50mL容量瓶中，加入1%氯化鎂溶液15mL，水定容至刻度，搖勻。配制成0.00，2.00，10.00，50.00，100.00，150.00，200.00μg／mL甘氨酸標準溶液。

衍生緩沖溶液：配制4.9mmol／L硼砂–0.25mmol／L氫氧化鈉（pH9.0）硼酸鹽緩沖溶液。

分離緩沖溶液：配制8.2mmol／L磷酸氫二鈉–3.5mmol／L磷酸二氫鉀（pH6.8）磷酸鹽緩沖溶液。

1.3樣品預處理

稱取5.00g純奶置于25.0mL具塞刻度試管中，加入1%氯化鎂溶液15mL，用水定容至標線，超聲5min，將混合液倒入燒杯中，電爐加熱至微沸，靜置冷卻至室溫，待蛋白顆粒沉淀長大，離心分離5min，上層清液經0.3μm針頭式過濾器過濾備用。

1．4電泳分離檢測條件

未涂層彈性石英毛細管柱（60cm×75μm，有效長度49cm）；壓力進樣:25kPa，3s；電泳電壓：25kV；電泳溫度：室溫；檢測波長：570nm；運行緩沖溶液：8.2mmol／L–磷酸氫二鈉–3.5mmol／L磷酸二氫鉀（pH6.8）。

毛細管在使用前用1mol／L氫氧化鈉沖洗20min，然后用二次蒸餾水和分離緩沖液各沖洗5min。每次分析樣品后，用緩沖溶液沖洗毛細管柱2min，以保證重現性。

2結果與討論

2．1樣品前處理方法的優化

2.1.1沉淀劑的選擇

稱取5.00g純奶于25.0mL具塞試管中，分別用磺基水楊酸、三氯乙酸、內酯和氯化鎂作為蛋白沉淀劑。對于純奶樣，用磺基水楊酸作為沉淀劑時檢測奶樣時出現雜峰，影響檢測結果。用三氯乙酸沉淀奶樣時蛋白沉淀不完全，而內酯為沉淀劑時，加入茚三酮衍生試劑，樣品不顯色。采用氯化鎂作為蛋白沉淀劑，不僅可以使蛋白質沉淀完全，而且處理后的樣品與茚三酮溶液顯色明顯，檢測時無雜峰且測量值穩定，因此實驗選擇氯化鎂作為蛋白沉淀劑。

2.1.2樣品處理操作

純奶樣加入氯化鎂沉淀劑后，在加熱時，為防止爆沸，避免沉淀蛋白渾濁，加熱至微沸后，奶樣靜置、冷卻至室溫，使蛋白聚集變大，利于蛋白沉淀完全。

2．2衍生條件

2.2.1衍生緩沖溶液pH值

由于茚三酮溶液與甘氨酸的反應是在酸性的條件下進行的，選擇pH6.80的磷酸鹽［7］作為衍生反應的緩沖溶液，與文獻［10–11］提供的緩沖溶液比較，該條件下樣品反應完全，顯色穩定。

2.2.2茚三酮溶劑

分別選擇乙二醇、純水、乙腈、丙酮和無水乙醇作為茚三酮的溶解溶劑進行試驗。樣品沸騰是顯色的重要條件，選用乙二醇或水作為茚三酮溶液溶劑時，樣品在沸水浴中不沸騰、不顯色。乙腈作為溶劑時，茚三酮易溶解，但乙腈毒性較大。丙酮作為溶劑，其沸點較低，沸水浴時爆沸，測定結果不穩定。采用無水乙醇作為溶劑，樣品加熱不爆沸且顯色明顯，測定結果重現性較理想，因此選擇無水乙醇作為茚三酮的溶解溶劑。

2.2.3加熱條件

選用無水乙醇作為茚三酮的溶解溶劑，在12min水浴時，樣品中加入沸石，防止溶液爆沸，將試管固定于支架上，水浴自動控溫裝置將溫度控制在96℃，電動攪拌器的轉速為250r／min，此條件下，樣品加熱更均勻、穩定，改善了樣品測定的重現性。

2.2.4氯化鎂溶液及沸石對衍生反應的影響

經實驗證明，樣品中加入氯化鎂溶液對衍生反應有增敏效應，甘氨酸茚三酮衍生強度提高一倍；樣品中加入沸石對衍生反應有加速和增敏雙重效應，反應時間由15min縮短為12min，衍生強度增加一倍，結果見圖1。

2．3電泳條件

2.3.1檢測波長

在紫外區，波長為230nm處檢測時，茚三酮有很大吸收，甘氨酸與茚三酮衍生后，峰值變化不明顯；在可見區，波長為570nm處檢測時，茚三酮吸收值小，背景影響小，檢測甘氨酸衍生物時，有較大吸收值，并且隨甘氨酸濃度的增加響應值呈線性增加，因此選用可見區波長570nm作為檢測波長。

2.3.2分離緩沖溶液pH值

在緩沖溶液為酸性條件進行檢測時，甘氨酸–茚三酮衍生物無吸收峰；選擇堿性的緩沖溶液（pH9.0）時，可檢測出甘氨酸–茚三酮衍生物的吸收峰，且隨甘氨酸含量的增加衍生物的響應值呈線性增加，因此選擇pH9.0的硼酸鹽溶液作為分離緩沖溶液。

2．4線性與檢出限

配制成0.00，2.00，10.00，50.00，100.00，150.00，200.00μg／mL的甘氨酸標準溶液，按照1.4的條件測定峰面積Y，方法的相關系數≥0.999，結果見表1。本方法選擇標準系列中檢出限進樣濃度2μg／mL計算該方法的檢出限，結果見表1。

2．5方法的重現性和精密度

隨機抽取不同生產廠家純奶樣進行檢測，取樣量5.00g，按照1.3和1.4的條件進行處理，測定結果如表2。純奶樣中甘氨酸含量的高效毛細管電泳譜圖如圖2。

2．6回收試驗

對表2中的純奶樣1進行加標回收試驗，結果見表3。由表3可知，回收率為88.7%～107.2%，說明方法的準確度較高。

3結語

利用高效毛細管電泳儀選擇性測定了純奶樣中的甘氨酸的含量，克服了分光光度法只能測定氨基酸的總量的缺點，解決了茚三酮顯色重現性差的問題。該法靈敏度較高，結果較滿意，可用于乳品生產的產品檢驗。