抗生素開始用作畜禽飼料添加劑。近年來隨著養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，為了治療、預(yù)防動物疾病和促進(jìn)其機(jī)體生長，相當(dāng)一部分飼養(yǎng)者違規(guī)超量使用抗生素。抗生素濫用導(dǎo)致環(huán)境中抗生素殘留已成為一個嚴(yán)重的生態(tài)問題［1–2］。抗生素經(jīng)使用后，相當(dāng)一部分以原物或代謝物的方式隨糞便排出。抗生素大多為*性化合物，具有親水、揮發(fā)性弱等特征，因而水體是抗生素類污染*重要的“匯”。目前已從地下水、河水、城市污水等多種環(huán)境水體中檢出抗生素［3–4］。

分屬于四環(huán)素類的四環(huán)素（TC）、土霉素（OTC）及分屬于大環(huán)內(nèi)酯類的羅紅霉素（ROX）是常用的抗生素類藥物。目前，測定上述抗生素殘留檢測方法很多，大致分為3類，一是生物測定法，包括微生物測定法（microbiologicalassay）、放射受體測定法（redioreceptorassay）等；二是儀器分析法，包括波譜分析、紫外分析、熒光分析、高效液相色譜分析、氣相色譜分析、液質(zhì)聯(lián)用分析等；三是免疫分析法，包括酶聯(lián)免疫測定法（EIA，ELISA）、膠體金免疫層析法等［5–9］。其中測定四環(huán)素、土霉素及羅紅霉素多用微生物法、酶聯(lián)免疫法和液相色譜法，但這些方法存在特異性差、靈敏度低等缺點(diǎn)。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法選擇性高，特異性好，靈敏度高，且能*大程度地避免假陽性［10–12］。筆者利用固相萃取（SPE）濃縮凈化，結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC–MS／MS）分析技術(shù)，采用外標(biāo)法建立了同時檢測地表水及城市污水中四環(huán)素、土霉素及羅紅霉素殘留的方法，測量精密度、準(zhǔn)確度符合要求。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1主要儀器與試劑

超高效液相色譜三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀：UPLC–XEVO–TQMS型，美國Waters公司；全自動固相萃取儀：6位CaliperAutotraceSPE，美國Caliper公司；氮吹儀：EYELAMG–2200型，日本EYELA公司；乙腈、甲醇：均為色譜純，美國Merck公司；甲酸：色譜純，美國Tedia公司；氫氧化鈉、硫酸：均為優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Na2EDTA：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；四環(huán)素、鹽酸土霉素、羅紅霉素色譜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：德國Dr.EhrenstorferGmbH公司；其它試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水或去離子水。

1.2儀器工作參數(shù)

1.2.1色譜條件

色譜柱：UPLCBEHC18型（50mm×2.1mm，1.7μm），美國Waters公司；柱溫：40℃；進(jìn)樣體積：1μL；流動相：甲酸溶液（體積分?jǐn)?shù)為0.01%）–乙腈，梯度洗脫程序見表1，流速為0.3mL／min。

1.2.2質(zhì)譜條件

采用正離子電噴霧離子源（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式。其相關(guān)質(zhì)譜條件見表2。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

固相萃取小柱依次用6mL二氯甲烷、6mL甲醇、6mLNa2EDTA溶液進(jìn)行活化。將500mL水樣加入0.5gNa2EDTA，調(diào)pH后過小柱，富集完成后用10mL水淋洗，氮吹20min，用10mL洗脫液分2次進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，氮吹至近干后用初始流動相定容，過0.2μm膜進(jìn)樣分析。

2結(jié)果與討論

2.1色譜條件優(yōu)化

分別選擇乙腈、甲醇與甲酸溶液配合作為流動相進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用甲醇作為流動相時，色譜圖基線偏高，響應(yīng)值偏低，而乙腈作為流動相時，色譜圖基線穩(wěn)定，響應(yīng)值較高。

采用正離子電離模式進(jìn)行質(zhì)譜檢測時，常使用具有一定酸度的流動相，以使目標(biāo)物容易質(zhì)子化而帶正電荷，通過提高離子化效率增強(qiáng)檢測的靈敏度。比較了0.01%，0.05%和0.1%的甲酸及純水作為流動相對抗生素分離效果的影響，結(jié)果表明，0.01%甲酸分離效果*佳且目標(biāo)化合物有較高的響應(yīng)值，實(shí)驗(yàn)*終選擇乙腈和0.01%甲酸混合溶液作為流動相。

2.2質(zhì)譜條件優(yōu)化

四環(huán)素類是兩性物質(zhì)，分子結(jié)構(gòu)中同時含有酸性基團(tuán)和堿性基團(tuán)，電離時會同時產(chǎn)生正負(fù)離子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明正離子采集的信號較強(qiáng)，因此以正離子方式（ESI+）進(jìn)行采集。采用質(zhì)量濃度為1mg／L的目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液以Infusion的方式進(jìn)行母離子全掃描，得到其準(zhǔn)分子離子峰，然后分別以其準(zhǔn)分子離子為母離子，通過氬氣碰撞產(chǎn)生碎片離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，選擇豐度較高的碎片離子作為定性與定量特征離子，選擇MRM掃描模式對母離子與子離子進(jìn)行碎裂電壓及碰撞電壓的優(yōu)化，提高檢測的靈敏度，優(yōu)化后的參數(shù)見表2。

2.3固相萃取條件優(yōu)化

SPE柱類型、洗脫劑和洗脫劑用量、上樣體積和流速、pH等都會影響SPE萃取的效率，筆者以空白加標(biāo)回收率為評價依據(jù)分別對這些實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化。

分別考察了HLB柱和普通C18小柱對目標(biāo)化合物的萃取效果，HLB柱填充的是親水、親脂平衡的水可浸潤型的反相吸附劑，研究發(fā)現(xiàn)，HLB對目標(biāo)化合物的萃取效率遠(yuǎn)高于C18柱，因此選擇HLB小柱對樣品進(jìn)行富集和凈化。

比較了樣品pH對提取效率的影響。發(fā)現(xiàn)提取效率在pH3時優(yōu)于pH7時，因此水樣和活化小柱所采用的Na2EDTA溶液均用1mol／L硫酸溶液調(diào)至pH3。

分別用甲醇、乙腈、酸化的甲醇（0.1%甲酸溶液）、乙酸乙酯、乙酸乙酯–甲醇（1∶4）作為洗脫液進(jìn)行洗脫，發(fā)現(xiàn)使用酸化的甲醇洗脫效率*高且重現(xiàn)性好，因此洗脫液采用含0.1%甲酸的甲醇溶液。

上樣流速分別為5，10，15mL／min時，發(fā)現(xiàn)空白加標(biāo)的回收率在流速為5，10mL／min時沒有顯著差異，而在流速為15mL／min時回收率有明顯下降，所以選擇上樣速率為10mL／min。

2.4標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖

TC，OTC，ROX3種目標(biāo)化合物標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖如圖1所示。由圖1可見，在1.2儀器工作條件下，3種目標(biāo)化合物5min內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)良好分離。

2.5線性范圍、檢出限和精密度

將TC，OTC，ROX儲備液（200mg／L）用初始流動相稀釋至標(biāo)準(zhǔn)溶液系列（TC，OTC1.0～100μg／L，ROX0.1～10μg／L），按照1.2儀器工作條件進(jìn)行分析。以定量離子對的響應(yīng)面積與對應(yīng)濃度進(jìn)行線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。目標(biāo)化合物在此范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。以10μg／L的標(biāo)準(zhǔn)溶液（ROX1μg／L）重復(fù)進(jìn)樣7次驗(yàn)證儀器精密度，發(fā)現(xiàn)7次進(jìn)樣的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%～5.6%。以2～5倍基線噪音響應(yīng)對應(yīng)的濃度進(jìn)行空白加標(biāo)，以3倍信噪比（S／N）估算方法檢出限，3種目標(biāo)化合物的檢出限介于0.08～0.35ng／L之間，其線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限見表3。

2.6水樣分析及加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

在空白水樣中分別添加目標(biāo)化合物進(jìn)行空白加標(biāo)回收試驗(yàn)，采用外標(biāo)法定量。為了考察不同的水體機(jī)制對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的影響，同時進(jìn)行了實(shí)際水樣的加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果列于表4。由表4可知，TC，OTC，ROX3種目標(biāo)化合物在空白水和實(shí)際水樣中的加標(biāo)回收率分別為82.5%～114%和71.5～126%，測量準(zhǔn)確度能夠滿足實(shí)驗(yàn)的需要。

3結(jié)語

用超高效液相色譜三重四*桿質(zhì)譜聯(lián)用法測定水中的四環(huán)素、土霉素、羅紅霉素，分析速度快，精密度、準(zhǔn)確度良好，檢出限低，適合快速檢測各種水體中的抗生素類污染物。