生物體的生長發(fā)育、損傷應(yīng)激、免疫應(yīng)答，以及體內(nèi)細(xì)胞分化凋亡等一切生命活動(dòng)由各種各樣的過程所調(diào)控。其中泛素化及其“逆過程”去泛素化就是重要的調(diào)控機(jī)制，它們在體內(nèi)形成動(dòng)態(tài)平衡，并幾乎參與了所有的生命活動(dòng)。由于這兩個(gè)過程與腫瘤、心血管等疾病的免疫與發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，近年來，已成為研究熱點(diǎn)與重要藥物的新靶標(biāo)。

 

病原菌在與宿主長期的相互“斗爭”中，會(huì)分泌一些具有去泛素化酶活性的“壞蛋分子”，干擾宿主泛素化過程，降低宿主免疫能力并促進(jìn)病原菌的“侵襲”。一直以來，探索新型去泛素化酶及其功能與作用機(jī)制，是科學(xué)家*為關(guān)注的話題。

 

近日，浙江大學(xué)生命科學(xué)研究院朱永群教授團(tuán)隊(duì)在國際上首次發(fā)現(xiàn)了一個(gè)來源于名為“嗜肺軍團(tuán)菌”的病原菌中特異地切割線性泛素鏈的全新去泛素化酶，并揭示了其在病原菌與宿主相互作用中的重要功能及機(jī)制。相關(guān)研究成果發(fā)表于《自然—微生物》雜志。

 

一個(gè)長期的科學(xué)疑問

 

在人、動(dòng)植物等真核生物的細(xì)胞中廣泛存在著泛素分子，它們是“路標(biāo)”，指示著需要被降解的蛋白質(zhì)或者發(fā)出特定的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方向。而泛素分子會(huì)通過泛素化過程，在泛素激活酶、泛素結(jié)合酶和泛素連接酶的依次催化下，會(huì)形成不同連接形式的多聚泛素鏈，包括異肽鍵連接的泛素鏈和泛素分子“首尾相連”的線性泛素鏈，參與調(diào)節(jié)信號通路。

 

“線性泛素鏈作用很重要，其擁有獨(dú)特的構(gòu)象，只能被一些特殊的蛋白識別，從而介導(dǎo)很多重要的信號通路調(diào)節(jié)，影響重要的生理過程，如細(xì)胞凋亡，胚胎發(fā)育、自噬等。”朱永群告訴《中國科學(xué)報(bào)》。

 

與此同時(shí)，真核細(xì)胞內(nèi)還存在著大量的去泛素化酶，與泛素化“針鋒相對”，它能夠切割泛素鏈，釋放泛素分子并在“有需要的地方”被循環(huán)利用，因此，去泛素化酶在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的“調(diào)節(jié)器”作用。

 

已有研究表明，這些去泛素化酶主要是針對異肽鍵的泛素鏈，針對線性泛素鏈的就只有一個(gè)名為OTULIN的特異切割的去泛素化酶。

 

不過，對于“OTULIN”如何起作用，科學(xué)家們之間莫衷一是。

 

朱永群表示，OTULIN雖然能夠“切割”線性泛素鏈，但有人認(rèn)為它直接具有去泛素化酶活性，有人認(rèn)為它只是作為一個(gè)“調(diào)節(jié)分子”，催化一個(gè)特殊的泛素連接酶LUBAC活性，使其起作用。“兩種觀點(diǎn)分別發(fā)表在《自然》和《細(xì)胞》兩家**期刊上，爭議很大。”

 

闡明相關(guān)機(jī)制很重要，因?yàn)樵诓≡c宿主的“斗爭”中，線性泛素鏈參與宿主免疫防御過程，具有很強(qiáng)的抑制細(xì)菌侵染的能力。朱永群進(jìn)一步解釋道，細(xì)菌“入侵”宿主之時(shí)，會(huì)分泌大量的毒性效應(yīng)蛋白，也就是“毒素”，毒素進(jìn)入細(xì)胞便開始“鳩占鵲巢”，它作用于宿主細(xì)胞關(guān)鍵信號分子，改變宿主正常的信號通路，拮抗宿主免疫防御和促進(jìn)病原菌侵染，從而順利“存活”。

 

過去的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多個(gè)具有去泛素化酶活性的效應(yīng)蛋白，但全部都是切割異肽鍵連接的泛素鏈，“是否存在特異地切割線性泛素鏈的去泛素化酶效應(yīng)蛋白？這是病原菌領(lǐng)域里長期以來存在著一個(gè)科學(xué)疑問。”朱永群說。

 

一個(gè)簡單新穎的實(shí)驗(yàn)

 

“這個(gè)很難做。”朱永群坦承，病原菌不計(jì)其數(shù)，其分泌的效應(yīng)蛋白也成千上萬，誰具有切割線性泛素鏈的去泛素化酶活性呢？

 

朱永群團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一個(gè)“簡單”卻很“新穎”的實(shí)驗(yàn)。

 

此前，他們研究發(fā)現(xiàn)，病原菌只有與宿主細(xì)胞接觸時(shí)才會(huì)分泌“毒素”。而事實(shí)上，當(dāng)病原菌生活在營養(yǎng)充足并開始快速生長的后對數(shù)生長期時(shí)，效應(yīng)蛋白就已經(jīng)被表達(dá)了，只不過尚未分泌出來而已。

 

由于泛素和泛素鏈只存在于真核生物中，研究人員設(shè)想，如果將病原菌培養(yǎng)到后對數(shù)生長期，將其制備成細(xì)菌裂解液，然后利用它在體外切割泛素鏈。“病原菌細(xì)胞裂解后，效應(yīng)蛋白釋放在試管中，如果裂解液能夠?qū)⒎核劓溓懈畛蓡蝹€(gè)泛素分子，表明該細(xì)菌裂解液具有去泛素化酶的活性。”朱永群說。

 

隨后研究人員根據(jù)這一設(shè)想建立了實(shí)驗(yàn)體系，利用這一篩選體系，對43種不同的病原菌進(jìn)行篩選，成功發(fā)現(xiàn)嗜肺軍團(tuán)菌的裂解液能夠切割線性泛素鏈，表明嗜肺軍團(tuán)菌含有切割線性泛素鏈去泛素化酶活性的效應(yīng)蛋白。

 

“這很有意思。”朱永群說。嗜肺軍團(tuán)菌就是人類“空調(diào)病”的病原菌，它常存在于空調(diào)的冷凝水中，被人呼吸到肺部后，就會(huì)在肺部里面‘干壞事’。它分泌300個(gè)毒性效應(yīng)蛋白到宿主細(xì)胞中，在巨噬細(xì)胞內(nèi)，嗜肺軍團(tuán)菌建立了獨(dú)特的膜泡結(jié)構(gòu)作為“大本營”，在里面大量增殖，*后導(dǎo)致巨噬細(xì)胞死亡，被釋放出來的細(xì)菌再進(jìn)行新一輪的感染。“當(dāng)巨噬細(xì)胞死亡的越來越多，就會(huì)引發(fā)‘空調(diào)病’。”

 

然而，究竟是嗜肺軍團(tuán)菌中哪個(gè)效應(yīng)蛋白切割的線性泛素鏈？研究人員從該菌中克隆了149個(gè)功能未知效應(yīng)蛋白，在體外進(jìn)行針對線性泛素鏈的去泛素化酶活性實(shí)驗(yàn)，成功篩選出**的一個(gè)名為RavD效應(yīng)蛋白。隨后的實(shí)驗(yàn)表明，RavD只特異地切割線性泛素鏈，對其它類型的泛素鏈不起作用。

 

一種新工具

 

“RavD效應(yīng)蛋白是一個(gè)全新的去泛素化酶。”朱永群表示，通過解析它的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)RavD具有獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)，不同于先前發(fā)現(xiàn)的所有去泛素化酶。

 

更重要的是，研究人員發(fā)現(xiàn)RavD被嗜肺軍團(tuán)菌分泌后，會(huì)持續(xù)性地切割膜泡上形成的線性泛素鏈，避免膜泡上線性泛素鏈的累積，達(dá)到抑制宿主NF-κB免疫信號的目的。這樣的結(jié)果導(dǎo)致，已被感染的細(xì)胞無法發(fā)出“求救信號”，處于一種仍然“健康”的假象中。

 

事實(shí)上，不止是在嗜肺軍團(tuán)菌中，RavD廣泛存在于軍團(tuán)菌屬細(xì)菌中。

 

與前述爭議較大的OTULIN不同，RavD有望被開發(fā)成研究線性泛素鏈的全新工具，促進(jìn)真核細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究。

 

“未來，我們希望對我們發(fā)現(xiàn)的獨(dú)特效應(yīng)蛋白進(jìn)行蛋白工程上的改造，使它們能成為生物醫(yī)學(xué)研究和臨床診治的工具。對于一些感染至關(guān)重要的效應(yīng)蛋白，我們希望能幫助研發(fā)新型抗菌藥物，解決日益嚴(yán)重的病原菌耐藥性問題。”朱永群說。