蜂蜜中含有獸藥殘留的主要原因是在蜂病防治過程中所使用的抗生素類獸藥未遵守休藥期規(guī)定、非法使用違禁藥物、不合理用藥等。農(nóng)藥殘留是指蜜蜂在外出采蜜時，花蜜來源的農(nóng)作物噴灑了農(nóng)藥，蜜蜂將其攜帶回蜂箱導(dǎo)致蜂產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留。

     蜂蜜中主要的殘留抗生素種類主要有氯霉素類、β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類和硝基呋喃類等。農(nóng)藥殘留主要涉及除蟲劑、除草劑和殺菌劑等。中國、日本、歐盟等國家和地區(qū)相繼制定了嚴(yán)格的技術(shù)性法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)，并不斷降低檢測限，增加藥物項目種類。我國也為此制定了一系列蜂蜜中農(nóng)獸藥殘留的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)，國內(nèi)外關(guān)于蜂蜜中農(nóng)獸藥殘留的檢測標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)文獻(xiàn)也有大量文獻(xiàn)報道。農(nóng)獸藥殘留檢測技術(shù)主要包括兩個方面:一是樣品前處理技術(shù)；二是檢測技術(shù)。本文從樣品預(yù)處理和檢測兩個方面對蜂產(chǎn)品重點農(nóng)獸藥殘留檢測技術(shù)進(jìn)行介紹。

      一、蜂蜜中農(nóng)獸藥殘留的樣品預(yù)處理方法
     蜂蜜是一種成分*為復(fù)雜的糖類復(fù)合體，到目前為止，已經(jīng)鑒定出蜂蜜中含有180多種不同的物質(zhì)。其中成熟蜂蜜總含糖量達(dá)75%以上，水分占18%～22%，其他成分還包括酸類、礦物質(zhì)、維生素、酶類、蛋白質(zhì)、氨基酸、膠體物質(zhì)等。這些物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)、分子大小、理化性質(zhì)各異，其中許多化合物的性質(zhì)目前尚不明確，其中任何一種物質(zhì)的含量可能是獸藥殘留組分的數(shù)百倍甚至數(shù)萬倍以上。這些樣品基質(zhì)的存在，不僅干擾對待測物的檢測，還會污染儀器和降低設(shè)備的使用壽命。樣品處理的*終目的是將待測組分從樣品基質(zhì)中分離出來，并達(dá)到分析儀器能夠檢測的狀態(tài)，其主要作用包括將藥物從樣品中釋放出來，除去樣品中的干擾雜質(zhì)，將待測組分轉(zhuǎn)換為可檢測的形式、達(dá)到可檢測的濃度范圍和溶于可分析的介質(zhì)。

樣品處理通常包括提取、凈化、濃縮和衍生化4個步驟。在設(shè)計樣品處理方法時應(yīng)考慮樣品的理化性質(zhì)、存在狀態(tài)、樣品基質(zhì)的化學(xué)組成、干擾物的可能存在類型、處理方法對藥物穩(wěn)定性的影響和采用的測定方法。

     1.提取方法

     提取就使用物理的和化學(xué)的手段破壞待測組分和樣品基質(zhì)之間的結(jié)合力，將待測組分從樣品中釋放出來并轉(zhuǎn)移到易于分 析的溶液狀態(tài)。樣品提取常用的方法有組織搗碎法(勻漿)、振蕩法、渦旋法、超聲波輔助提取、超臨界流體萃取、索氏提取法、加速溶劑萃取、微波輔助提取等。在蜂蜜農(nóng)獸藥殘留中*常用的是振蕩提取和渦旋混勻。由于蜂蜜中主要是易溶于水的糖類物質(zhì)，國標(biāo)和文獻(xiàn)中的方法多為用水稀釋后，渦旋混勻，經(jīng)過離心處理后，取上清等待進(jìn)一步凈化處理。

      2.凈化方法
     在樣品提取過程中，許多與待測組分溶解性相似的雜質(zhì)將被一起轉(zhuǎn)移出來，凈化就是將待測組分與雜質(zhì)進(jìn)行分離。提取過程一般可以去除99%以上的樣品基質(zhì)，這些不到1%的共萃取物是主要的樣品測試的干擾雜質(zhì)，尤其是對于質(zhì)譜檢測，會引起嚴(yán)重的基質(zhì)效應(yīng)，同時也可能會增加基線噪聲，降低柱效，阻塞色譜管路等。有時這些雜質(zhì)可能不會直接干擾檢測，但大量的雜質(zhì)會干擾色譜分離過程，導(dǎo)致待測物峰形異常和保留值變異增加。因此，為保證測定的正常進(jìn)行，必須在凈化過程中去除這些雜質(zhì)。常用的凈化方法有液-液萃取、固相萃取、固相微量萃取、凝膠滲透色譜法、基質(zhì)固相分散技術(shù)、免疫親和色譜、分子印跡技術(shù)、膜萃取等。蜂蜜中抗生素殘留檢測用到的主要是固相萃取法，OASIS HLB的反相保留機(jī)理的固相萃取柱，在蜂蜜中抗生素殘留檢測中用途*廣。

     3.濃縮、富集和衍生化方法
     在殘留分析中，經(jīng)過提取和凈化后的待測組分的存在狀態(tài)經(jīng)常不能滿足儀器分析的要求，如濃度低于檢測器的響應(yīng)范圍、待測物的溶劑與色譜不兼容等。因此需要進(jìn)行濃縮、富集，或進(jìn)行溶劑轉(zhuǎn)換。減壓蒸餾和氣流吹蒸是常見的濃縮方法。當(dāng)待測物在選定的檢測器上無響應(yīng)或靈敏度太低，或其理化性質(zhì)不適于進(jìn)行色譜分離時，可進(jìn)行化學(xué)衍生化以改變組分的性質(zhì)，使其能夠在檢測器上產(chǎn)生響應(yīng)或改善色譜行為。50°C下氮氣吹干，是蜂蜜樣品*常用的濃縮方法。蜂蜜中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮代謝物殘留量的測定方法，需要對樣品進(jìn)行衍生化處理，因為4種硝基呋喃類抗生素是以簡單的代謝物的形式存在于樣品中，而4種化合物代謝物的分子量較小(<200)，質(zhì)譜響應(yīng)較弱，檢測靈敏度低，所以需要衍生化提高質(zhì)譜檢測靈敏度。

     二、蜂蜜中農(nóng)獸藥殘留的儀器檢測方法
     按分離或檢測原理不同，殘留分析可分為理化分析方法，如色譜法及其聯(lián)用技術(shù)、波譜法等；免疫分析法，如放射免疫測定法、酶免疫測定法、熒光免疫測定法等；生物測定法，如微生物學(xué)測定法、放射受體測定法等。蜂蜜中農(nóng)獸藥殘檢測標(biāo)準(zhǔn)中主要應(yīng)用的檢測技術(shù)包括:液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相質(zhì)譜色譜聯(lián)用法、杯碟法、酶聯(lián)免疫法等。

     1.色譜法
     色譜法分為氣相色譜法(GC)、液相色譜法(HPLC)、薄層色譜法(TLC)、毛細(xì)管電泳(CE)。其中，氣相色譜法適合分離沸點比較低、熱穩(wěn)定性好的化合物。高效液相色譜法特別適用于高沸點、大分子、強(qiáng)*性和熱穩(wěn)定性差的化合物的分析。薄層色譜法具有設(shè)備簡單、操作方便、分析速度快的優(yōu)點，但是定量的準(zhǔn)確性差，只是一種定性方法。與HPLC相比，毛細(xì)管電泳法具有操作簡單、色譜柱不受樣品污染、分析速度快、分離效率高、樣品用量少、運行成本低等優(yōu)點，但毛細(xì)管電泳遷移重現(xiàn)性、進(jìn)樣準(zhǔn)確性和檢測靈敏度方面不及HPLC，在殘留分析的應(yīng)用中受到一定限制。目前殘留分析中，HPLC和GC，由于其強(qiáng)大的分離能力、強(qiáng)健的穩(wěn)定性，并且能夠?qū)崿F(xiàn)與各種檢測方法連在一起，已成為主流的分析方法。

     (1)液相色譜法和氣相色譜法
     色譜法是利用物質(zhì)在液相和固相或者氣相和固相中吸附或分配系數(shù)的微小差異而達(dá)到分離目的。其*大的特點在于能將復(fù)雜的混合物分離為各個有關(guān)的組分后，逐個加以檢測。色譜法具有高效、快速、靈敏的特點，液相色譜與氣相色譜相比，其*大特點是可以分離不可揮發(fā)而具有一定溶解性的物質(zhì)或受熱后不穩(wěn)定的物質(zhì)，而這類物質(zhì)在已知化合物中占相當(dāng)大的比例。

     蜂蜜中農(nóng)獸藥殘留檢測中液相色譜法和氣相色譜法都有應(yīng)用。蜂蜜中鏈霉素、四環(huán)素類、磺胺類、甲硝達(dá)唑類等采用液相色譜串聯(lián)紫外檢測器或二*管陣列檢測器進(jìn)行檢測，方法的檢出限在0.01mg/kg，但是隨著一些獸藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)的提高，0.01mg/kg的檢出限水平已經(jīng)不能滿足檢測的需要。氣相色譜法一般用于檢測蜂蜜中的農(nóng)藥殘留，如有機(jī)磷農(nóng)藥、殺蟲脒、雙甲脒等、菊酯類農(nóng)藥等，方法的檢出限也在0.01mg/kg左右。

     (2)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法
     色質(zhì)聯(lián)用一般是指液相色譜或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，它以液相色譜或氣相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測系統(tǒng)。樣品在質(zhì)譜部分和流動相分離，被離子化 后，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開，經(jīng)檢測器得到質(zhì)譜圖。色質(zhì)聯(lián)用體現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢的互補(bǔ)，將色譜對復(fù)雜樣品的高分離能力，與MS具有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點結(jié)合起來，在藥物分析、食品分析和環(huán)境分析等許多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。

隨著液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展，蜂蜜中抗生素殘留的檢測標(biāo)準(zhǔn)中采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法的占多數(shù)，主要包括氯霉素、四環(huán)素類、青霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、磺胺類、喹諾酮類、頭孢類、硝基呋喃類等抗生素的檢測。較液相色譜法，液質(zhì)聯(lián)用方法的檢出靈敏度大大提高，方法的檢出限在(0.1～10)μg/kg范圍內(nèi)，比液相色譜法的靈敏度提高3～5個數(shù)量級。氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測的比較多，蜂蜜中雙甲脒、殺蟲脒、溴螨酯等農(nóng)藥殘留的檢測標(biāo)準(zhǔn)均使用了氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，方法靈敏度在(10～40)μg/kg范圍內(nèi)。

      2.酶聯(lián)免疫分析法
     免疫分析是以抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的分析技術(shù)。免疫反應(yīng)涉及抗原與抗體分子間高度互補(bǔ)的立體化學(xué)、靜電、氫鍵、范德華力和疏水區(qū)域的綜合作用，因而具有單獨任何一種理化分析技術(shù)難以達(dá)到的選擇性和靈敏度，非常適用于復(fù)雜基質(zhì)中痕量組分的分離或檢測。但是，免疫測定法提供的待測物組成或結(jié)構(gòu)方面的信息太少(僅為吸收度或計數(shù))，一般不具備多殘留分析能力；免疫分析過程復(fù)雜，影響因素眾多且不易控制，結(jié)果易出現(xiàn)假陽性，方法難以標(biāo)準(zhǔn)化；方法建立過程復(fù)雜，研究周期長，某些待測物的半抗原難以合成。免疫測定法不可能取代色譜或光譜等常規(guī)分析方法，只能作為其重要補(bǔ)充。蜂蜜中四環(huán)素、泰樂菌素、氯霉素等抗生素還有使用酶聯(lián)免疫法的國家標(biāo)準(zhǔn)，但是使用率不高。

     3.微生物測定法
     微生物法是用于測定抗生素效價的生物學(xué)定量方法之一。標(biāo)準(zhǔn)的方法是以20mL的瓊膠培養(yǎng)基放入陪替氏培養(yǎng)皿內(nèi)做成平面，上面加上預(yù)先培養(yǎng)的試驗標(biāo)準(zhǔn)菌種，例如摻入了葡萄球菌的瓊膠4mL，而使之凝固，上面再放上一個外徑8mm的不銹鋼圓筒，筒內(nèi)倒?jié)M青霉素稀釋液后，在35℃～37℃培養(yǎng)(12～16)h。由于圓筒周圍產(chǎn)生濃度梯度，葡萄球菌的繁殖被阻止于有效濃度范圍之內(nèi)而形成圓形的透明帶。其直徑d與青霉素濃度c之間的關(guān)系如下式所示:d=klog10c+a(k、a為常數(shù)) 與標(biāo)準(zhǔn)青霉素液相比較，可求得青霉素濃度。測定鏈霉素時用枯草菌，氯霉素用大腸菌，四環(huán)素用八連球菌作繁殖試驗。此外還有用圓形濾紙代替圓筒，使被檢液滲入的濾紙法。微生物學(xué)測定法原理和操作簡單，目前在抗微生物藥物殘留的快速分析中仍發(fā)揮作用，但不能準(zhǔn)確定量。

      4.其他快速檢測方法
      針對蜂蜜中抗生素、農(nóng)藥殘留等安全問題，一些快速檢測方法應(yīng)運而生，比如采用間接競爭的酶聯(lián)免疫試劑盒法、膠體金試紙條法等。這些方法檢測速度快、成本低、便于操作，可用于現(xiàn)場執(zhí)法，也可用于大規(guī)模篩選。因此，快速檢測方法是上述國標(biāo)方法的有益補(bǔ)充。

轉(zhuǎn)載自中國計量網(wǎng)